DNA的复制与修复.ppt

第十四章DNA的复制与修复 DNA的复制 反转录以及DNA损伤的修复 主要内容 一 DNA的复制 一 DNA的半保留复制 semicoservativereplication 1958年Meselson和Stahl用同位素示踪和密度梯度离心的方法证明了DNA的半保留复制 二 与DNA复制有关的酶和蛋白质 1 DNA聚合酶 DNAPolymerase 又称DNAnucleotidyltransferase orDNA directedDNApolymerase orDNA dependentDNApolymerasei e DDDPase DNA聚合酶催化的反应 DNA聚合酶的作用机理 在大肠杆菌中至少发现了五种DNApolymerase 分别是DNApolymeraseI II III IV和V 其中PolymeraseI发现最早 1956年 而polymeraseIV和V直到1999年才发现 DNApolymeraseI polI 1956年Kornberg等在Ecoli中发现的第一个DNA聚合酶 是DNA复制研究中的重要里程碑 因此于1959年Kornberg获得诺贝尔化学奖 DNApolI也称Kornberg酶 Mr103Kd 一条多肽链 一个锌原子 活性所必需 每个E Coli细胞内大约有400个分子的polI 1 5 3 聚合作用 2 3 5 核酸外切酶的活性 3 5 3 核酸外切酶的活性 4 焦磷酸解作用 5 焦磷酸基交换的作用因此它属于一种多功能酶 功能 1 5 3 聚合作用 DNApolI不能 从无到有 只能从已有的多核苷酸链的3 OH端延长DNA链 也就是说必须要有Primer primer多数情况下是RNA 少数情况下是DNA Primer必须要有一个游离的3 OH 模板 单链DNA 单链线状DNA 单链环状DNA 局部变成了单链的双链DNA有切口 nick 的双链DNA有缺口 gap 的双链DNA注意 完整的双链DNA不能作模板 单链线状DNA 单链环状DNA B 局部变成了单链的双链DNA C 有切口 nick 的双链DNA D 有缺口 gap 的双链DNA A 单链DNA 用胰蛋白酶或其他蛋白水解酶处理DNApolI可以得到两个片段 A 大片段 第324 928氨基酸残基组成 Mr68000 具有聚合酶的活性和3 5 核酸外切酶的活性 这大片段称Klenowfragment B 小片段 第1 323个氨基酸残基组成 Mr35000 具有5 3 核酸外切酶的活性 大片段 3 5 核酸外切酶主要功能校对 5 3 核酸外切酶的主要功能在DNA修复和切除引物中起作用 小片段 PolII是由一条Mr为88Kd的多肽链组成 它的活性大约只有polI活性的5 也要模板和带3 OH的引物 最好的模板是带短的gap的双链DNA 有5 3 聚合酶和3 5 核酸外切酶的活性 但没有5 3 核酸外切酶的活性 主要用于DNA的修复 DNAPolymeraseII DNApolII 1970年和1971年先后分离出polII和polIII 是由多种蛋白质组成的复合物 Mr高达900Kd 每个Ecoli约含10分子DNApolIII 虽然polIII的量很少 但活性很强 为polI的15倍 模板和polII大致相同 除聚合酶活性外 还具有3 5 核酸外切酶的活性 但无5 3 核酸外切酶的活性 DNApolIII是原核细胞DNA复制的主要酶 它催化脱氧核苷酸的合成速率达到体内DNA的合成速率 这个酶的缺陷株往往是致死的 DNApolymeraseIII DNApolIII DNApolymeraseIV和V DNApolIV和V 1999年才被发现 涉及DNA的错误倾向修复 当DNA受到严重损伤时 即可诱导产生这两种酶 使修复缺乏准确性 因而出现高的突变率 大肠杆菌三种DNA聚合酶的比较 真核生物DNApol 有DNApol 5种 除DNApolr存在于线粒体内 其余均存在于细胞核中 它们的差别除了细胞定位外 主要在于动力学性质和对抑制剂的敏感性不同 其他性质基本上同Ecoli的聚合酶 也需要模板 带3 OH的引物和4种脱氧核苷三磷酸 链的延伸方向为5 3 哺乳动物DNA聚合物 2 DNA连接酶 DNAligase 3 使DNA双螺旋解开所需的酶或蛋白质 1 DNAhelicase DNA解螺旋酶 DNA解旋酶 DNA解链酶 目前已知E Coli含有4种解螺旋酶 即解螺旋酶I II III和Rep蛋白 其中Rep蛋白是E Coli中最主要的解螺旋酶 每解开一个碱基对需水解2分子ATP 通过水解ATP打断互补双链间的氢键 通过水解ATP获得能量 使双螺旋DNA两条链分开 2 Single strandbindingproteins SS B 单链结合蛋白 功能 与解开双螺旋后的单链DNA结合 防止单链DNA重新形成双螺旋 另外防止单链DNA被核酸酶降解 原核生物的SS B与单链DNA的结合表现为正协同效应 而真核生物的SS B就没有这种协同效应 这酶首先在E Coli中发现 当时称 蛋白 后来在真核生物中也发现了类似活性的酶 真核生物中的这类酶名称各不相同 有称nicking closingenzyme 切口开合酶 切口闭合酶等 untwistingenzyme 解缠酶 3 topoisomeraseI 拓扑异构酶I TopI 这个酶的功能是切开超螺旋双链DNA中的一条链 链的切口末端就可转动 使DNA变成松驰状态 然后再将切口封闭 这酶作用时不消耗ATP 它的功能也是使超螺旋松驰 在消耗ATP的情况下 能将复制叉前方产生的正超螺旋变成负超螺旋 在无ATP时 可同时切开超螺旋的两条链 使DNA变成松驰状态 然后将切口封接好 克服解链过程中在复制叉前方造成的 打结 现象 4 topoisomeraseII 拓扑异构酶II TopII 这酶首先也是在E Coli中发现 也称DNAgyrase DNA旋转酶 TopI和TopII使超螺旋松驰机制的相似处和不同处 三 DNA的复制过程 1 DNA复制的起点和方向 原核生物 1个起点 originofreplication 复制起点 复制原点 复制起点核苷酸序列的特征 1 碱基序列高度保守 2 富含AT 有利于DNA的解链 方向 大多为双向复制 E Coli染色体DNA 复制 复制时有一个复制起点 双向展开 形成 状中间物 直至两个复制叉相遇 这种复制称 复制 复制子 受同一个复制起始区控制的DNA被称为复制子 replicon 它是复制的功能单位 原核细胞DNA复制只有一个复制起始区 因此它只有一个复制子 通常细菌 病毒和线粒体的DNA分子都是作为单个复制子完成复制的 真核生物 有很多复制起点 复制方向也是双向 真核细胞的细胞核DNA复制有多个复制起始区 因此它包含多个复制子 起点 起点 在复制的起始点处 DNA双链部分解开为单链 形成叉子形状称复制叉 replicationfork 大多数生物DNA的复制是双向的 但也有例外 如滚环式复制 rollingcirclereplication 2 DNA的半不连续复制 semi discontinuousreplication 所有已知的DNA聚合酶的合成方向都是5 3 1968年日本学者Okazaki冈崎提出了DNA的不连续复制模型 他认为3 5 走向的DNA链的合成是不连续的 是由许多5 3 方向合成的DNA片段连接起来的 这些不连续的DNA片段称为冈崎片段 Okazakifragment 原核细胞冈崎片段的长度为1000 2000个核苷酸 相当于1个顺反子 cistron 的大小 即基因的大小 真核生物冈崎片段的长度为100 200个核苷酸 相当于1个核小体DNA的大小 3 5 走向的DNA链是不连续的 另一条链根据最近的实验 认为5 3 走向的DNA链是连续的 因此称semidiscontinuousreplication 在DNA复制时 以3 5 方向为模板合成的一条新链是连续的 称前导链 leadingstrand 它的延伸方向与复制叉的移动方向相同 另一条新链的合成是不连续的 由许多5 3 方向的冈崎片段组成 这条新链称后随链 laggingstrand 它的延伸方向与复制叉的移动方向相反 DNA聚合酶不能 从无到有 地合成多核苷酸链 只能从已有的多核苷酸链上延长 这个已有的多核苷酸链就是引物 所以DNA的合成必须要有引物 体内的引物多数情况下是RNA 但也可利用体内原有的DNA片段 RNA引物是以单链DNA为模板 沿5 3 方向合成小分子RNA引物 在大肠杆菌中RNA引物 RNAprimer 由引发酶 primase 催化 引物的长度1 60个核苷酸 引物的长度取决于物种 3 DNA的合成需要以RNA为引物 合成RNA引物的过程称引发 引发是一个十分复杂的过程 Preprimosome预引发体或称前引发体 4 引发 primosome引发体 priming引发 a 大约20个DnaA蛋白各带1个ATP结合到4个9bp的重复序列上 DNA缠绕在上面 形成起始复合物 initialcomplex b HU蛋白是类组蛋白 可与DNA结合 促进起始 受其影响 邻近的三个13bp重复序列被变性成开链复合物 opencomplex 即解链而形成 小段单链 所需能量有ATP供给 c DnaB 解链酶 在Dnac的帮助下结合于解链区 DnaB借助水解ATP产生的能量 沿DNA链5 3 方向移动 解开DNA的双链 此时称为preprimingcomplex i e preprimosome 再与引发酶 primase 组装成引发体 primosome 才能起引发作用 5 DNA复制叉的结构和链的延长 DNA复制时 DNA双螺旋的解开靠helicase 解螺旋酶 SS B TopII i eDNAgyrase RNA引物合成后 DNApolIII与复制叉结合 形成复制体 replisome 的结构 而启动DNA的合成 replisome 为大的多分子复合物 由DNApolIII以及其他酶和蛋白质组成 组装于细菌染色体的复制叉 并在DNA复制中完成各种各样的反应 复制起点解开后形成2个复制叉 进行双向复制 前导链和后随链的合成都需要RNA引物 前导链先由引发酶在起点处合成一段RNA引物 随后DNApolIII即在引物上加脱氧核苷酸 前导链的合成与复制叉的移动保持同步 后随链的合成是分段进行的 需要不断合成冈崎片段的RNA引物 然后由DNApolIII加入脱氧核苷酸 后随链的合成比较复杂 由于DNA的两条互补链方向相反 为使后随链能与前导链被同一个DNApolIII不对称二聚体所合成 后随链必须绕成一个环状 loop 合成冈崎片段不断与模板脱开 然后在新的位置又与模板结合 6 链的终止 1 除去引物 DNApolI 有5 3 核酸外切酶的活性 可把RNA引物除去 所出现的缺口 gap 由DNApolI按模板要求将缺口填满 2 DNA连接酶将相邻的两个核苷酸的磷酸二酯键连接起来成大分子DNA 再形成一定的空间结构 DNA复制总结 真核生物DNA复制与原核生物DNA复制大体相同 但有差异 1 原核生物每时每刻都在复制 而真核生物DNA的复制在细胞周期的S期 2 原核生物DNA的复制只有1个复制起始点 而真核生物DNA的复制有许多复制起始点 3 原核生物与真核生物DNA复制的酶不同 切除引物的酶亦不同 4 真核生物的DNA与组蛋白组装成核小体 5 端粒和端粒酶 真核生物染色体DNA是双链线状 由于DNA合成需要RNA作引物 引物除去后 5 端留下一段无法填补的空缺 这样DNA复制后就会愈来愈短 而生物体有端粒酶来解决这个问题 端粒 telomere 指真核细胞线状染色体末端的DNA序列 端粒酶 telomerase 由RNA和蛋白质组成的一个复合物 以端粒酶中的RNA 有特殊的序列 为模板 通过反转录合成端粒DNA 二 反转录 逆转录 reversetranscription 1970年有人从致癌RNA病毒中发现了依赖于RNA的DNA聚合酶 RNA dependentDNApolymeraseRDDPme or称RNA指导的DNA聚合酶 RNA directedDNApolymerase 即反转录酶 reversetranscriptase RT 能以RNA为模板合成DNA DNA 转录 反转录 RNA 后来在胚胎细胞和正常细胞中也分离得到了这种酶 反转录酶的发现使中心法则更完善 复制 DNA 转录 反转录 RNA 翻译 蛋白质 反转录酶催化的反应 反转录现象发现的生物学意义 三 DNA的修复 DNA复制的速度很快 每分子酶每分钟合成约1000个核苷酸片段 E Coli5 106bp 30min human3 109bp 8h 另外生物体生长的环境中种种物理和化学因素可作用于DNA 引起DNA结构的改变 使DNA受到损伤 damage 生物体有修复系统可使受损伤的DNA得到修复 1 光复活作用 photoreactivation 光复活酶 photoreactivatingenzyme 1 损伤 形成嘧啶二聚体 2 形成酶 DNA复合物 光复合酶结合于损伤部位 3 酶被可见光所激活 4 修复后释放酶 5 3 5 3 h 2 切除修复 excisionrepair 3 重组修复 recombinationrepair 4 错配修复 mismatchrepair 错配修复实际上是一种特殊的核苷酸切除修复 它专门用来修复在DNA复制中出现的新合成DNA链上的错配的碱基 但如何避免将DNA链上正确的碱基切除呢 这就需要将oldstrand和newstrand区分开来 原核生物利用甲基化区分oldstrand和newstrand 因此原核细胞中的错配修复也称甲基化指导的错配修复 methyl directedmismatchrepair 原核细胞DNA的甲基化位点位于5 GATC序列中腺嘌呤碱基的6位N原子上 催化甲基化的酶为Dam甲基化酶 Dammethylase 刚