课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数.doc

实验2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数课题背景尿素-是一种重要的农业氮肥，但尿素不能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。一、筛选菌株1、尿素是一种重要的氮肥，农作物 不能 直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为氨，这是因为细菌能合成 脲酶 。2、实验室中微生物的筛选应用的原理：人为提供有利于 目的菌生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。3、方法：选择培养基在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。加入青霉素的培养基：细菌不生长，酵母菌、霉菌等真菌能生长；不加含碳有机物的无碳培养基：分离自养型微生物；加入高浓度的食盐的培养基：可选择培养金黄色葡萄球菌等。拓展如何判断选择培养基是否起到了选择作用?制备牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，将稀释相同倍数菌液分别涂布在牛肉膏蛋白胨和选择培养基上，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长菌落数目明显多于选择培养基上的数目，用来判断选择培养基起到了选择作用。二、统计菌落数目1、常用方法：稀释涂布平板法、显微镜直接计数法。2、稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目（又叫间接计数法或活菌计数法）原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。公式：每mL样品中的菌株数=（CV）M；C代表计数的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液体积，M代表稀释倍数。为了保证结果准确，在同一稀释度下一般设置35个平板（至少3个），选择菌落数在30300的平板进行计数，并取平均值。 缺点：统计的菌落数往往比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。3、显微镜直接计数法显微镜直接计数中，也可对样液适当稀释，制作装片时要先盖盖玻片，后滴加样液在盖玻片边缘，使其自行渗入。公式：每毫升原液所含细菌数每小格平均细菌数40010000稀释倍数；缺点：不能区分细菌的死活。【例】每一个大方格边长为 1mm ，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，载玻片与盖玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3。下面以一个大方格有25个中方格的计数板为例进行计算：设五个中方格中总菌数为A，菌液稀释倍数为B，那么，一个大方格中的总菌数是多少?1ml菌液中的总菌数?(1ml=1cm3=1000mm3）【答案】 5A 5AB1044、细菌的数目还可以通过 滤膜法 来测定：饮用水过滤后，滤膜放在伊红美蓝培养基上培养，计数黑色大肠杆菌菌落。三、设置对照实验的主要目的：设置对照的主要目的是:排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。对照实验是指除了被测试的条件以外，其他条件都相同的实验，其作用是比照试验组，排除任何其他可能原因的干扰，证明确实是所测试的条件引起相应的结果。四、实验设计1、土壤取样：铲去表层土，在距地表约38cm的土壤层取样。2、制备培养基：分别配置牛肉膏蛋白胨培养基和以尿素为唯一氮源的选择培养基。（牛肉膏蛋白胨培养基作为对照,用来判断选择培养基是否起到了选择作用）3、样品的稀释和涂布：为保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板，通常选用一定稀释倍数的样品进行培养：测定土壤中细菌的数量，一般选用104、105、106 倍稀释；测定放线菌的数量，一般选用103、104、105倍稀释； 测定真菌的数量，一般选用102、103、104 倍稀释。（原因：不同微生物在土壤中含量不同）4、微生物的培养与观察：不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌：3037 ，12天；放线菌：2528，57天；霉菌：2528， 34 天。5、 计数：每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以防止因培养时间不足而导致一楼菌落的数目。五、操作提示 取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。 应在火焰旁称取土壤10 g。将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。 在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。 实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。 为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当事先规划时间。六、鉴定分解尿素细菌的方法：在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨。氨会使培养基的碱性增强，PH升高。因此，我们可以通过检测培养基pH变化来判断该化学反应是否发生。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。七、教材中思考题答案1、教材P22实验中两位同学的实验需要改进吗？如何改进？ 第一位同学需设置重复实验组；第二位同学统计的三个菌落数相差太大，说明操作有误，需重新实验。2、教材P23 A同学的两个对照试验。（1）由其他同学用与甲同学一样的土样进行实验。如果结果与甲同学一致，则证明甲无误；如果结果不同，则证明甲同学存在操作失误或培养基的配制有问题。 （2）将甲同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。八、存留疑问例（2018全国卷，37）将马铃薯去皮切块，加水煮沸一定时间，过滤得到马铃薯浸出液。在马铃薯浸出液中加入一定量蔗糖和琼脂，用水定容后灭菌，得到M培养基。回答下列问题：（1）M培养基若用于真菌的筛选，则培养基中应加入链霉素以抑制_的生长，加入了链霉素的培养基属于_培养基。（2）M培养基中的马铃薯浸出液为微生物生长提供了多种营养物质，营养物质类型除氮源外还有_ （答出两点即可）。氮源进入细胞后，可参与合成的生物大分子有 （答出两点即可）。（3）若在M培养基中用淀粉取代蔗糖，接种土壤滤液并培养，平板上长出菌落后可通过加入显色剂筛选出能产淀粉酶的微生物。加入的显色剂是_，该方法能筛选出产淀粉酶微生物的原理是_ 。（4）甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定某一土壤样品中微生物的数量，在同一稀释倍数下得到以下结果：甲同学涂布了3个平板，统计的偏落数分别是110、140和149，取平均值133；乙同学涂布了3个平板，统计的菌落数分别是27、169和176，取平均值124。有人认为这两位同学的结果中，乙同学的结果可信度低，其原因是 。【解析】（1）M培养基若用于真菌的筛选，说明M培养基能满足真菌的生长，而能抑制其它微生物的生长，链霉素是一种抗生素，可以抑制细菌的生长。加入了链霉素的培养基能筛选出真菌，该培养基属于选择培养基。（2）微生物生长需要多种营养物质除氮源外，还需要碳源、无机盐、水以及特殊营养物质等。【答案】（1）细菌(1分)选择(2分) （2）碳源、无机盐(2分)蛋白质、核酸(2分) （3）碘液(2分)淀粉遇碘液显蓝色，产淀粉酶的菌落周围淀粉被水解，形成透明圈(3分)（4）乙同学的结果中，1个平板的计数结果与另2个相差悬殊，结果的重复性差(3分)命题点(一)土壤中分解尿素细菌的分离与计数1(2017全国卷)某些土壤细菌可将尿素分解成CO2和NH3，供植物吸收和利用。回答下列问题：(1)有些细菌能分解尿素，有些细菌则不能，原因是前者能产生_。能分解尿素的细菌不能以尿素的分解产物CO2作为碳源，原因是_。但可用葡萄糖作为碳源，进入细菌体内的葡萄糖的主要作用是_(答出两点即可)。(2)为了筛选可分解尿素的细菌，在配制培养基时，应选择_(填“尿素”“NH4NO3”或“尿素NH4NO3”)作为氮源，不选择其他两组的原因是_。(3)用来筛选分解尿素细菌的培养基含有KH2PO4和Na2HPO4，其作用有_(答出两点即可)。解析：(1)土壤中的某些细菌之所以能够分解尿素，是因为它们能产生脲酶。尿素分解菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物，必须利用现成的有机物(如葡萄糖)作为碳源；葡萄糖通过呼吸作用被分解时，能为细胞生命活动提供能量，同时，葡萄糖还可以转化成脂肪、某些氨基酸等物质，所以进入细菌体内的葡萄糖能为其他有机物的合成提供原料。(2)选择培养基只是允许特定种类的微生物(目的微生物)生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。本实验的目的菌是可分解尿素的细菌，因此配制的培养基应只允许尿素分解菌生长，NH4NO3可以作为所有细菌的氮源，培养基中如含有NH4NO3，将不能起到筛选作用。(3)KH2PO4和Na2HPO4能为细菌生长提供钾盐、钠盐和磷酸盐，而H2PO/HPO可作为缓冲剂，使培养基中pH保持相对稳定。答案：(1)脲酶分解尿素的细菌是异养生物，不能利用CO2来合成有机物为细胞生命活动提供能量，为其他有机物的合成提供原料(2)尿素其他两组都含有NH4NO3，能分解尿素的细菌和不能分解尿素的细菌都能利用NH4NO3，不能起到筛选作用(3)为细菌生长提供无机营养，作为缓冲剂保持细胞生长过程中pH稳定2(2016四川高考)图甲是从土壤中筛选产脲酶细菌的过程，图乙是脲酶基因转录的mRNA部分序列。(1)图中选择培养基应以_为唯一氮源；鉴别培养基还需添加_作指示剂，产脲酶细菌在该培养基上生长一段时间后，其菌落周围的指示剂将变成_色。(2)在5个细菌培养基平板上，均接种稀释倍数为105的土壤样品溶液0.1 mL，培养一段时间后，平板上长出的细菌菌落数分别为13、156、462、178和191。该过程采取的接种方法是_，每克土壤样品中的细菌数量为_108个；与血细胞计数板计数法相比，此计数方法测得的细菌数较_。(3)现有一菌株的脲酶由于基因突变而失活，突变后基因转录的mRNA在图乙箭头所示位置增加了70个核苷酸，使图乙序列中出现终止密码(终止密码有UAG、UGA和UAA)。突变基因转录的mRNA中，终止密码为_，突变基因表达的蛋白含_个氨基酸。解析：(1)脲酶能够催化尿素分解释放出氨和二氧化碳，因此选择培养基中应以尿素为唯一氮源。挑取单菌落接种到加有酚红指示剂的鉴别培养基中，培养一段时间后，菌落周围的氨增加，pH升高，酚红指示剂将变红。(2)该过程采取的接种方法为稀释涂布平板法。利用稀释涂布平板计数法对细菌进行计数时，应选择菌落数在30300的平板，因此平板上长出的细菌菌落平均数为(156178191)3175个。每克土壤样品中的细菌数为1750.11051.75108个。血细胞计数板计数法能将死细胞计算在内，而稀释涂布平板计数法只能计数活细胞(只有活细胞才能在平板上生长)，故一般血细胞计数板计数法要比稀释涂布平板计数法的结果大。(3)箭头处插入70个核苷酸，箭头后密码子的解读方式为*AG，UGA，GAA对比3种终止密码可发现，此处的终止密码为UGA。从起始密码到终止密码之前共有27372个碱基，因此突变基因表达的蛋白质含115个氨基酸。答案：(1)尿素酚红红(2)稀释涂布平板法1.75少(3)UGA115重难点拨统计菌落数目的两种方法(1)显微镜直接计数法：原理利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量方法用计数板计数缺点不能区分死菌与活菌(2)间接计数法(活菌计数法)：原理当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌计算公式每克样品中的菌株数(CV)M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数操作设置重复组，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板进行计数3(2018郴州质检)分解尿素的微生物广泛存在于农田等土壤中，某生物实验小组尝试对分解尿素的微生物进行分离与计数。请回答下列问题：(1)分解尿素的微生物能产生_酶；配制培养基时应以_作为唯一氮源。(2)培养基中添加_作为指示剂，培养后，培养基pH会_(填“升高”或“降低”)，可使指示剂变红色。(3)对尿素溶液进行灭菌的最适方法是_。(4)该小组在接种前，随机取若干灭菌后的空白平板先培养一段时间，这样做的目的是_；然后将1 mL样液稀释10 000倍，在3个平板上用涂布法分别涂布0.1 mL稀释液；经适当培养后，3个平板的菌落数分别为39、42和45。据此可得出每毫升样液中分解