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小混混与诺贝尔奖 玩着等他的诺贝尔奖 PCR技术发明者凯利 穆利斯 主讲教师生命科学与食品工程学院林娜 1 诺贝尔奖颁发的时间 2 在你的心目中 出色的科学家给你的印象是什么 在普通大众的心目中 出色的科学家大多是一些头上罩着神圣光环的人物 霍金被誉为是坐在轮椅上的 爱因斯坦 他身上能自主支配的肌肉只有3个指头 纳什则是个精神病患者 发作时 连他美丽的妻子都不相认 不说他们的科学贡献 就凭这些事迹即足以令人生出一份敬畏之情 但穆利斯却是一个快乐的科学家 他说 我感激诺贝尔评奖委员会 在我还能够尽情享受生活的年龄及时地把诺贝尔奖授予给我 这是凯利 穆利斯在1993年获得诺贝尔奖时所讲的一段话 当时他49岁 这份坦率令他走下神坛混迹于大众之中 基本简历 1944年出生于美国北卡罗来纳州1966年 自然 发表题为 时光逆转的宇宙学意义 1972在加州大学伯克利分校取得博士学位1993年的诺贝尔化学奖1998年的自传 心灵裸舞 心灵裸舞 在一个注重包装 注重标榜的年代 这是一本坦率真诚的书 它能让我们享受到一种阅读快感 图书馆杂志 无论读者是否同意穆利斯 或相信他在书中描绘的某些经历 他的古怪而又经常富有洞察力的关于科学和生活的见解将令人重新审视自己的信仰 科库斯评论 我已有很久没有读到这么能延伸思维 激荡灵感的好书了 与众不同 idear 22岁时的他 向世界顶级科学杂志 自然 投了一篇题为 时光逆转的宇宙学意义 的稿子 那时他还只是一个生化系的二年级研究生 他阅读了大量有关天文学方面的书籍 同时还服了一些致幻药物 本该没有理由被这家权威杂志接受 但文章居然登出来了 他一跃成为该领域的专家 穆利斯之所以选择成为一名生化学家而不是天体物理学家 是因为他作了理智的权衡 那是1966年 他琢磨 一旦冷战结束 苏联不再成为美国的威胁 国会议员对资助外层空间研究的热情就将减退 因为没有一个人能具体地接触到这些虚无飘渺的空间 但政府将一如既往地资助人体及医学科学研究 他的选择看来是对的 所以 穆利斯力主科研经费应当更多地放在与人类生存有关的项目上 而不是那些很玄奥的东西 与众不同 idear 霍金一定不喜欢这样的说法 这就是化学家与理论物理学家的区别 正是这种区别的存在提醒我们 这是一个真实的世界 Awards 1990年获美国的威廉姆 艾仑纪念奖 1991年获国家生物技术奖和 研究与进展 杂志年度科学家 1992年获加利弗尼亚科学家年度奖 1993年获托马斯 爱迪生奖 1998年入选国家发明家名人录 特立独行 穆利斯的个性独特 易于激动 可以使与他工作的人兴奋不已 对复杂问题能有巧妙的解决方法 他兴趣广泛 发表过诗歌 散文和小说 虽然他学习化学 但发表了物理学方面的论文 他不很善于与人合作 与实验室的其他科学家多次产生磨擦 他拒绝承认PCR成功的重要原因是PCR小组集体努力的结果 当然 他是最先提出PCR概念的 并坚信它具有光明前景 PCR技术 能将微量的DNA大幅增加 因此 无论是化石中的古生物 历史人物的残骸 还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发 皮肤或血液 只要能分离出一丁点的DNA 就能用PCR加以放大 进行比对 这也是 微量证据 的威力之所在 PCR polymerasechainreaction 即聚合酶链式反应 是指利用耐热DNA聚合酶的反复作用 通过变性 复性 延伸的循环操作 在体外迅速将DNA模板扩增数百万倍的一种操作技术 1PCR的概念 2PCR技术简史 体内DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明 引物酶 引物酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 KaryB Mullis 1944 在Cetus公司工作期间 发明了PCR 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼 1983年春夏之交的一个晚上 他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物 而不是一个引物 去扩增模板DNA的想法 很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖 Mullis是其中之一 1983年春天一个周五的晚上 Mullis开车的时候 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链 自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶 面对面地合成着DNA 引物 引物 Mullis的构思 DNA聚合酶 DNA聚合酶 94 变性 50 退火 XX 延伸 1979年 穆利斯进入Cetus 西特斯 公司 他很有个性 经常提出很多奇谈怪论 很多是错误的 因为他对化学合成比较了解而对分子生物学不是很精通 同时他又喜欢锋芒毕露 好斗 跟同事之前矛盾很多 他喜欢研究计算机 分形理论 循环迭代 指数扩增 这可能也是他能发明PCR理论的关键 毕竟PCR的核心思想就是指数扩增 1983年 穆利斯在偶然发明了PCR原理之后 在公司内部根本无法得到别人的认可 每个人都戴着有色眼镜看它 去找理由证明它行不通 即使它看起来很简单 这也是一个新技术开发时的痛苦 就是怀疑的人总是大多数 不管它原理上有多么简单可行 1984年 由于与同事矛盾剧烈 公司讨论是否要开除穆利斯 最终公司还是没有开除他 给他一年时间开发PCR 后来公司成立了PCR组 派技术员协助 年底证明PCR可行 1985年 派技术员Saiki加入 在自动化的仪器出现之前 PCR需要长时间反复操作 到3月 公司准备申请专利 同时发表2篇文章 1986年 穆利斯离开西特斯 因为他要求公司发表的每篇PCR论文他都作为第一作者 与公司关系严重恶化 PCR的主要专利1987年被批准 第一个试剂和PCR仪在1988年上市 我不大喜欢动手 我宁肯不几动手 我不喜欢做费力的事 作为一个发明家 重要的一点是为解决某些问题而尽力设计一个简捷的动手方案 这是PCR的发明者Mullis在1991年对 研究与发展 杂志 RD 记者说的一番话 NO 10 44页 在这一年 Mullls当选为RD杂志的年度科学家 1993年穆利斯因为发明PCR获得诺贝尔化学奖 但回头来看 穆利斯提出了这个原理和概念 PCR发明的所有具体实现是西特斯公司的其他同事完成的 回顾整个过程 如果西特斯不是这么宽容 那么PCR这种边缘创新根本不可能得到付诸实践 也许早把穆利斯这种离经叛道的人给开除了 公司当时主要关注的是抗癌的产品例如白介素等 PCR只是一个边缘产物 不宽容的公司也不可能给这种边缘产品提供研发投入 所以 新技术的开发 很多时候是误打误撞再加坚持的结果 难以预测 这也是破坏式创新面临的问题 革命性的东西一开始都不是那么显而易见的 94 50 37 DNA聚合酶klenow片段 1986年 Mullis首次提出耐高温酶的使用 TaqDNA聚合酶 thermusaquaticus 酶活性 温度 405060708090100 10080604020 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶 Taq 引入了PCR技术 1973年台湾的钱嘉韵在辛辛那提大学生物系首次分离美国黄石公园热泉里的嗜热菌中分离的蛋白酶 72 94 50 PCR循环 TaqDNA聚合酶 PCR的发展史 1983年春 Mullis发展出PCR的概念 1983年9月 Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验 只用一个循环 1983年12月 用同位素标记法看到了10个循环后的49bp长度的第一个PCR片断 1985年12月20日 Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文 方法中用了PCR技术 导致Mullis的文章到处被拒 1985年10月25日申请了PCR的专利 1987年7月28日批准 专利号4 683 202 这回Mullis是第一发明人 1986年5月 Mullis在冷泉港实验室做专题报告 全世界从此开始学习PCR的方法 1986年6月 Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶 TaqDNApolymerase 这是85年春天Mullis建议做的 1988年 第一台PCR仪问世 1991年 HoffmanLaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权 标准的PCR反应体系4种dNTP混合物各200umol L引物各10 100pmol模板DNA0 1 2ugTaqDNA聚合酶2 5uMg2 1 5mmol L缓冲液10uL双蒸水至100uL 3反应体系 时间 min 重复1 3步25 30轮循环 目的DNA片段扩增100万倍以上 DNA双螺旋 DNA单链与引物复性 DNA变性形成2条单链 子链延伸DNA加倍 4PCR的基本原理 温度 PCR技术 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 模板DNA 高温变性 PCR的基本原理 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 引物1 引物2 低温退火 PCR的基本原理 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 引物1 引物2 Taq酶 Taq酶 适温延伸 PCR的基本原理 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 第1轮结束 PCR的基本原理 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 Taq Taq Taq Taq 第2轮 PCR的基本原理 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 第2轮结束 PCR的基本原理 PCR的基本原理 PCR反应条件PCR过程PCR的特点 模板DNA 第1轮扩增 第2轮扩增 第3轮扩增 第4轮扩增 第5轮扩增 第6轮扩增 PCR的基本原理 Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer 循环仪 94 55 72 Taq酶模板DNAdNTP引物Buffer产物 循环25 35次 5PCR的基本过程 PCR技术 PCR 琼脂糖凝胶电泳 最终产物 紫外光观察 3 4小时 第一代定性的PCR 6PCR的类型 不对称PCR反向PCR多重PCRLP PCR第二代荧光定量PCR 锚式PCRPCR固相分析法原位PCRRT PCR第三代PCR技术 数字PCR 研究基因克隆 DNA测序 分析突变诊断细菌 病毒 寄生虫检测 诊断人类基因组工程遗传图谱的构建 DNA测序 表达图谱法医犯罪现场标本分析肿瘤各种肿瘤检测其他 PCR的类型和应用 7PCR的应用 纪念KaryMullis获得诺奖30周年BeginningwithasinglemoleculeofthegeneticmaterialDNA thePCRcangenerate10