植物细胞组织培养研究.doc

细胞工程课程论文植物细胞组织培养研究摘要：植物组织培养是指利用细胞全能性培养再生植株的技术，具有快速繁殖、克服杂交不亲和及保存种质资源等优点。本文先介绍了植物组织培养的原理与发展历程，综述了植物细胞组织培养的研究与应用，主要介绍了其在农业、育种、育苗、人工种子及生物反应器中的相关研究情况与简单介绍。关键词：植物细胞；组织培养；研究进展；应用1 引言植物细胞与组织培养是细胞工程中一类重要的研究内容，其中植物组织培养是20世纪发展起来的技术，细胞培养技术也是是细胞工程的核心技术之一。二十世纪初(1902年)，德国植物学家GHaberlandt最早开始植物组织培养的研究，随着生产和科学水平的提高，植物组织培养技术已相当成熟和精确1。研究的领域从植物生理学科逐渐扩展到细胞生物学、分子生物学、遗传学、园艺学、育种学等学科1。植物的组织培养广义又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在无菌条件下接种在含有各种营养物质及植物激素的培养基上进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术2。狭义是指组培指用植物各部分组织，如形成层、薄壁组织、叶肉组织、胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。运用组织培养方法可以在比较简单易观察的条件下研究细胞、组织或器官的繁殖、生长和分化，以及各种外界因素对它们的影响，从而为解决农业生产和药物生产中的某些问题开辟了广阔的前景，目前已有若干重要成果应用于生产实践中3。2 植物细胞组织培养原理植物组织培养即植物无菌培养技术,又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，即每个植物细胞里都含有一整套遗传物质，只不过在特定条件下不会表达。将已处于分化终端或正在分化的植物组织脱分化，诱导形成愈伤组织，再在愈伤组织上形成新的丛生芽。具体可利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）、组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株。3植物组织培养发展史植物组织培养的研究可以追溯到20世纪初期，根据其发展情况，大体可以分为三个时期。3.1萌芽阶段组织培养技术的蓬勃发展只是近50年的事，但它的整个历史可以追溯至19世纪末和上世纪初。20世纪初，在Schleiden和Schwann所发展起来的细胞学说的推动下，1902年德国植物学家Haberlandt提出了高等植物的器官和组织为许多细胞组成的观点，以及植物细胞全能性的理论，即植物的体细胞，在适当的条件下，具有不断分裂和繁殖，发育成完整植株的潜在能力。他首次发表了植物离体细胞培养实验的报告。1912年，Habefiandt的学生Kotte和美国的Robins在根尖培养中获得了组织培养的成功。Kotte采用了无机盐、葡萄糖、蛋白胨、天冬酰胺，及添加各种氨基酸的培养基。Robins用含无机盐、葡萄糖或果糖的琼脂培养基，培养了长度为1.453.75cm的豌豆、玉米和棉花的茎尖，形成了一些缺绿的茎和根4。3.2奠基阶段自Haberlandt的实验之后，直到1934年美国的White由番茄根建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，并反复转移到新鲜培养基中继代培养，使根的离体培养实验获得了真正的成功，并在以后28年间培养了1600代。这之后，White又以小麦根尖为材料，研究了光、温度、通气、pH值、培养基组成等各种培养条件对生长的影响，并于1937年建立了第一个组织培养的综合培养基，其成分均为已知化合物，包括3种B族维生素，即吡哆醇、硫胺素和烟酸，该培养基后来被定名为White培养基。与此同时，Gautherer（1934）在研究山毛柳和黑杨等形成层的组织培养实验中，提出了B族维生素和生长素对组织培养的重要意义，并于1939年连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。同年，White由烟草种间杂种的瘤组织， Nobecourt由胡萝卜均建立了与上述类似的连续生长的组织培养物。因此，Gautherer，White和Nobecourt一起被誉为组织培养学科的奠基人。我们所用的培养方法和培养基，基本上都是由这三位科学家建立的。后来，White于1943年发表了植物组织培养手册专著，使植物组织培养开始成为一门新兴的学科4。3.3快速发展和应用阶段40年代Skoog和崔徵在烟草茎切段和髓培养以及器官形成的研究中发现，腺嘌呤或腺苷可以解除培养基中生长素（IAA）对芽形成的抑制作用，而能诱导形成芽，从而明确了腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。即这一比例高时，产生芽；这一比例低时，则形成根；相等则不分化。在寻找促进细胞分裂的物质过程中，Miller等人于1956年发现了激动素。不久即知道激动素可以代替腺嘌呤促进发芽，并且效果可增加3万倍。结果上述控制器官分化的激素模式变为激动素与生长素的比例关系。这方面的成功发现，有力地推动了植物组织培养的发展4。1952年；Morel和Martin通过茎尖分生组织的离体培养，从已受病毒侵染的大丽花中首次获得无病毒植株。19351945年Muir把单细胞放在一张铺在愈伤组织上面的滤纸上培养，使细胞发生了分裂，即实施了看护接种技术，使单细胞培养获得初步成功。1960年，Cocking等人用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得成功。1971年，Takebe等在烟草上首次由原生质体获得了再生植株，这不仅在理论上证明了无壁的原生质体同样具有全能性，而且在实践上为外源基因的导入提供了理想的受体材料。80年代中期以来，对禾谷类作物的原生质体培养也相继告捷，在这方面中国学者做出了重要贡献。1962年印度Guha等人成功地在毛叶曼陀罗花药培养中，由花粉诱导得到单倍体植株，从而促进了花药和花粉培养的研究4。以后相继在烟草、水稻、小麦、玉米、番茄、辣椒、草莓、苹果等多种植物培养中获得成功，其数目达到160多种，其中烟草、水稻和小麦等的花药育种培养在中国取得了引入注目的成就。1960年，Morel提出了一个离体无性繁殖兰花的方法，其繁殖系数极高。由于这一方法有很大的应用价值，很快被兰花生产者所采用，迅速建立起兰花工业。1973年Carlson等通过两个烟草物种之间原生质体融合，获得了第一个体细胞杂种，Cocking等倡导的原生质体培养和体细胞杂交，研究得到了迅速发展，已经能使矮牵牛和烟草属的杂种细胞增殖分化生成杂种植株4。在此后基因工程技术的发展推动下，组织培养有了进一步的飞速发展，尤其与二十一世纪头十年成熟起来的RNAi结合更加推动生命科学的研究进展。4应用研究进展截至目前，植物组织培养成功获得再生植株已经有1000多种5，在组织培养的外植体选择中，是能否成功获得离体培养的关键。常用的外植体包括原生质体、胚胎、细胞、器官等6-7。但更为关键的则是培养条件和培养基质8。4.1植物细胞组织培养在农业中的应用自从1983年转基因植物首次获得以来，植物基因工程研究逐渐进入蓬勃发展的阶段。植物基因工程是指利用重组技术，有计划地在体外通过人工方法将外源基因导入到受体中，从而获得目标性状。目前已育成了一大批耐抗病、除草剂、抗逆、抗虫的新品种，并已开始在农业生产上大面积推广应用。据统计，到目前为止，有3000多例转基因植物获得成功8。近年来做的主要工作仍然是将有重大应用价值的可行的基因导入植物受体，用农杆菌介导法和基因枪法转化，主要是目的基因对植物组织伤口的细胞进行转化，只有发生这些转化的植物细胞能够再生，长成完整的植株，获得转基因植株4。4.2在植物育种上的应用主要是种质资源的保存和脱毒。种质资源的保存时采用组织培养的方式来保存植物遗传形状，将植物的外植体放到无菌环境下进行离体培养，并置于低温或者超低温条件下保存，能达到长期保存种质资源的目的。离体种质资源的保存可以在常温下，也可以用常低温或者低温保存，如草莓茎尖在4 黑暗条件下，茎的培养物能保持生活力达6a左右，而这期间只需要每3个月加入一些新鲜培养基8。另外，有些植物还可以用超低温保存，也叫冷冻保存9。脱毒在现代化农业生产中有着重要的作用。农作物都不同程度地遭受到植物病毒的危害，据不完全统计，全球每年农作物因病毒病引起的作物损失达200多亿美元。植物脱毒可使植物复壮，提高产量和品质。如：甘薯脱毒后增产17158，使大中薯率提高6。前，通过组织培养脱毒可以实现商业化的无菌苗，在园艺领域已经十分普遍，如草莓、甘薯、马铃薯、柑桔、大蒜、苹果、康乃馨、矮牵牛、菊花、月季、花叶芋、山牡丹等已在中国广泛应用。据报道，日本正在筹建一个全自动的无土栽培基地，为减轻土地压力和进行现代化自动农产品生产。4.3工厂化育苗与人工种子在工厂育苗方面，利用组织培养可以使单株全年繁殖几万到几百万株。我国成功获得组培苗并已进行工厂化育苗的有月季、菊花、甘蔗、栎树、山楂、猕猴桃、樱桃、仙客来、杉木等4。人工种子的概念首先是1978年美国生物学家 提出来的，它是指植物离体培养中产生的不定芽或胚状体，被包裹在含有养分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中，从而形成能发芽出苗的颗粒体。人工种子的意义在于，人工种子结构完整，体积小，便于贮藏与运输，可直接播种和机械化操作，不受季节和环境限制，胚状体数量多，繁殖快，利于繁殖生育周期长、自交不亲和、珍贵稀有植物的工厂化生产，也可大量繁殖无病毒材料，可在人工种子中加入抗生素、菌肥、农药等成分，提高种子活力和品质，体细胞胚由无性繁殖体系产生，可以保持杂种优势8。4.4植物细胞生物反应器培养自从1960年Tuleche和Nickle首次报道在134 L生物反应器中成功培养不同植物种类以来，利用植物细胞大规模培养技术为植物有用代谢产物的生产提供了有效途径和生产方法。利用生物反应器来培养植物细胞相对与利用摇瓶来讲有两大优势,首先可以更好的控制反应系统(比如pH值和溶氧浓度可以在线监控等);第二点优势在于许多生物反应器可以放大,可以更好的运用于大规模的工业化生产。运用于植物细胞培养的生物反应器主要有:搅拌式反应器、气升式反应器、鼓泡式反应器、膜反应器、光照培养反应器和转鼓式反应器等。各种反应器都有自身的特点和优点,在选用反应器时要根据不同的植物细胞特点选取相应的反应器类型。在运用反应器培养植物细胞时反应器的操作策略也是多样的,如间歇培养、流加操作、连续培养和两段培养等。但在反应器培养时主要考察的参数是系统的溶氧速率以及其调控方式的优化10-11。利用植物细胞培养生产代谢产物具有十分广阔的前景，并不可争议地具有工业化潜力。5 展望植物组织培养技术已广泛应用于植物的各个领域，这项技术为许多学科研究工作者提供了良好试材和基体保障。通过植物组织培养，可以获得较稳定的体胚发生和不定芽体系，在组织培养基础上进行细胞悬浮培养及植物基因工程等研究工作，为植物通过基因工程改良植物打下了坚实基础，虽然还存在一些问题，如：组织培养周期长、受外植体类型限制、组培变异率高、再生诱导频率低，在培养过程中再生能力弱，再生苗生根困难等。因此，如何解决这些问题将是植物组织培养研究的重要方向和课题。总的来说是前景广阔，但任重而道远。参考文献1蔡建秀,肖华山.植物组织细胞培养的研究进展J.泉州师专学报,1999,17(6):38-422百度百科，植物组织培养3魏小春等.豆科植物组织和细胞培养研究进展J.贵州农业科学,2008,36(1):31-364刘庆昌，吴国良.