米蛋白糖基化论文.doc

精品文档1.1课题来源 哈尔滨市科技局攻关项目1.2 研究的目的及意义水稻是世界上最重要的农作物之一，全世界有40%的人口以大米为主食。水稻种子蛋白质含量占粒重的7%10%，其中主要是谷蛋白(占胚乳总蛋白的60%以上)，其次是醇溶蛋白，且前者易被人体消化，后者则不能1。可以说，大米是人们(尤其是亚洲人)蛋白质的基本来源。据统计，日本人消费的蛋白质近19%来自大米。我国是发展中国家，消费水平较低，来自大米的蛋白质消费比例可能更高。大米蛋白是公认的优质植物蛋白，具有氨基酸组成平衡2。大米蛋白是一种低抗原性蛋白，不会产生过敏反应 ，美国临床研究表明，在700个遗传性过敏症的病例中，高度过敏病人中对大米蛋白过敏的低于1%，而儿科过敏病人中很少对大米蛋白过敏。大米蛋白是公认的优质植物蛋白，具有氨基酸组成平衡合理和低过敏性等特点，适合作为婴幼儿和特殊人群的营养食品，国内外高度重视大米蛋白的研究和产品开发3。米谷蛋白是大米的主要储藏蛋白质，约占大米总蛋白质的80%以上。大米蛋白具有优良营养品质，主要表现在：(1)大米蛋白氨基酸配比较合理。大米蛋白氨基酸组成与小麦蛋白、玉米蛋白必需氨基酸组成及WHO推荐蛋白质氨基酸最佳模式(%)；(2)含赖氨酸高的谷蛋白占大米蛋白的80%左右，而品质差的醇溶蛋白含量很低。因此赖氨酸含量比其它一些粮食种子高；(3)生物效价高4-5。大米蛋白的生物价为77，不但在各种粮食中居第一位（包括大豆），而且可以和白鱼(生物价76)，虾（生物价77）及牛肉（生物价77）相媲美；(4)大米蛋白的消化率为85%，高于马铃薯74%，玉米窝头66%等其它谷物，且不含胆固醇。按照Osborne6的分类方法,大米蛋白质可分为清蛋白(Albumin)可溶解于水的蛋白质(4% 9% )；球蛋白(Globulin)可溶于稀盐的蛋白(10%11% )；醇溶蛋白(Gliadin)可溶解于70%乙醇的蛋白质(3%)；谷蛋白(Glutenin) 可溶于稀酸或稀碱的蛋白质，其中水不溶性的谷蛋白占66%78%一些禾谷类种子内的碱溶性蛋白质，是稻谷中的主要贮存蛋白质，占总蛋白质的80%90%，常与淀粉相互作用7。本文以大米蛋白中的米蛋白的分级分离和酶法修饰进行研究，采用淀粉酶法提取粗蛋白并对其进行纯化，重点提取谷蛋白,分析其组成,然后进行酶法修饰使其改性，提高米蛋白的功能性，然后对酶修饰后的米谷蛋白进行物化特性的研究。2.2大米蛋白的研究进展2.2.1蛋白质的功能特性蛋白质功能性质主要包括以下几个方面：（1）水合性质，取决于蛋白质与水的相互作用，如溶解性，持水性，粘度等；（2）表面性质，主要包括蛋白质乳化性和起泡性等；（3）蛋白质和蛋白质相互作用，体现在蛋白质凝胶作用和成膜性8。蛋白质的改性9就是人为地对蛋白质结构进行修饰。从分子水平看，改性实质是切断蛋白质分子中主链或是对蛋白质分子侧链基团进行修饰，使其氨基酸残基和多肽链发生某种变化，从而引发蛋白空间结构和理化性质改变，使蛋白功能特性和营养特性得到改善10。2.2.2物理改性蛋白质物理改性是指利用机械处理、热、挤压、冷冻、电、磁等物理作用形式，改变蛋白质的高级结构和分子的聚集方式。般不涉及蛋白质的级结构，主要用于蛋白的增溶和凝胶。Cherry11等发现通过冷冻保存，尤其当花生蛋白样品含有高浓度还原剂(二硫苏糖醇或-巯基乙醇)时，会促进其部分理化性质发生变化，如溶解性、电泳性质、分子量、结构、位阻及其它功能性。叶荣飞12等研究得出，热诱导大豆蛋白聚集生成了可溶聚集体，使得低浓度热处理后完全变性的SPI具有良好的溶解性。2.2.3化学改性 化学改性方法，包括酰化、脱酰胺、磷酸化、糖基化(即美拉德反应)、共价交联、水解及氧化等方法。化学改性是指采用化学方法改变蛋白质结构、静电荷和疏水基团。可通过烃化(作用于Lys，Cys，Met，His和Try)、氧化(作用于Cys，Met，His和Try)、酰化(Lys和Tyr)、酯化和氨基化(作用于Glu和Asp)反应实现13。姚玉静等采用乙酸酐和琥珀酸酐对SPI进行化学改性，结果得出：在中性和弱碱性(pH 5. 09. 0)范围内，酰化明显提高了SPI的EAI（乳化性）和ES，琥珀酰化的改性效果优于乙酰化14。李瑜15等用三聚磷酸钠对小麦面筋蛋白进行磷酸化改性，发现磷酸化小麦面筋蛋白溶解度、乳化度及稳定性、起泡性均比未改性前有极其显著的改善。卢寅泉等16用磺化苯乙烯阳离子树脂为强化剂对花生蛋白进行选择性催化脱酰胺，脱酰胺度与肽键水解度之比达32.4，提高了乳化能力、乳化稳定性、持水性和粘度。2.2.4 大米蛋白的淀粉酶法改性淀粉酶也是大米蛋白提取中常用的酶制剂。利用淀粉酶将大米淀粉降解为更易溶解的糊精和低聚糖，并通过离心或过滤的方法将其除去，相对提高沉淀物中的蛋白质含量。早期这种工艺缺点在于为了考虑淀粉糖浆(如麦芽糖浆等)的生产，液化不能过于彻底，否则使得上清液中产生过多的还原糖当量，降低了麦芽糖的产率，这样造成高蛋白米粉的蛋白含量远低于大豆浓缩蛋白，再加上其较差的溶解性，限制了其应用范围17。但基于上述原理，研究者们使用了更加高效而稳定的液化酶直接作用于大米粉，取得较好效果。Morita18以大米粉为原料用高温液化淀粉酶在97下反应2 h后过滤除去糖类物质得到了蛋白质含量达90%以上的大米分离蛋白。Shih19-20利用淀粉酶在90处理大米粉，使蛋白质的含量达到65%，其后进一步应用葡萄糖淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶处理可使蛋白质含量达76%，而且蛋白质仍保持其完整状态。淀粉酶法提取的大米蛋白要比蛋白酶法提取的纯度高，但功能性质方面不是很理想，有待进一步研究改进。2.3 糖基化作用改性2.3.1理论基础从报道的文献看，糖基化反应主要是基于蛋白质分子中氨基酸侧链的氨基和糖分子还原末端的羧基之间的羧氨反应，即美拉德反应。美拉德反应是由法国生物化学家Louis Camille Maillard(1878-1936)于1912年发现。美国化学家Hodge21于1952年首先提出了美拉德反应的网络系统分类图解，对该反应机理做了系统的论述。美拉德反应一般可以分为二个反应阶段，三条反应路线。随着研究的不断深入，许多科学家认为美拉德反应14-15可分成3个反应阶段，即初期(The earlystage)、中期(The advanced stage)和末期(The final stage)。在早期阶段，还原糖与氨基酸或蛋白质中的氨基缩合，形成席夫碱（Schiffs），经过糖-蛋白质酮胺结合物（Amadori）重排形成Amadori产物。在这一阶段，蛋白质与多糖的共价结合已经完成；在进展阶段，Amadori产物降解形成大量裂解产物；在最终阶段，前面的裂解产物继续反应，生成褐色色素类黑精，同时发生蛋白质交联反应。影响美拉德反应的因素有pH值、温度、反应时间、相对湿度，离子强度等22。糖蛋白共价复合物的制备主要有两种途径23，一种是干热法制备多糖蛋白共价复合物，一种是湿热法制备单糖或双糖蛋白质共价复合物。3主要研究内容3.1 淀粉酶法提取大米蛋白方法研究3.2 大米蛋白的糖基化改性研究3.3糖基化大米蛋白的结构表征3.4糖基化大米蛋白物化性质研究4 研究方案4.1 大米各组分的测定4.1.1 水分的测定 恒重法（GB/T5009.4-2003） 4.1.2 蛋白质含量的测定 凯式定氮法(GB/T5009.3-2003)4.1.4 淀粉含量的测定 淀粉酶解4.1.5 纤维素的测定 重铬酸钾碘量法4.2大米蛋白的提取及分级4.2.1大米蛋白的提取通过单因素实验，研究淀粉酶法提取大米蛋白中的固液比、加酶量、酶解温度和酶解时间等因素的影响，再通过正交试验优化淀粉酶法提取大米蛋白的工艺24。具体步骤：大米粉碎(80目)并过筛加水调浆糊化液化离心沉淀干燥大米浓缩蛋白称取米粉50g，80目过筛，加水搅匀，浆浓度达到30一35%，调节pH为6.5，加入定量的15000u/g的高温a-淀粉酶，用电炉快速加热到所需温度，再水浴恒温搅拌，到达设定时间后加2mol/L的HCI调pH至5.0灭酶，冷却，然后离心20min，用温水洗去沉淀物残余的糖，再离心20min，沉淀物于50烘20h，最后将大米浓缩蛋白粉碎过筛(40目)测定蛋白质含量。4.2.1.1固液比对大米蛋白提取率的影响采用固液比分别为1:2、l:3、1:4、1:5、l:6，加酶量为300u/g，酶解温度为80，酶解时间为90min，进行试验，测定大米蛋白的提取率。4.2.1.2加酶量对大米蛋白提取率的影响的试验设计调整加酶量分别为75u/g、150u/g、225u/g、300u/g、 375u/g、450u/g、525u/g、600u/g。其余实验条件为：固液比1:4、酶解温度为80，酶解时间为90min，进行试验，测定大米蛋白的提取率。4.2.1.3酶解温度对大米蛋白提取率的试验设计采用高温a-淀粉酶的适宜温度为80100，分别在75、80、85、90、95、 100，固液比l:4，加酶量为450u/g，酶解时间为90min，测定大米蛋白提取率。4.2.1.4酶解时间对大米蛋白提取率的试验设计本试验分别采用在30min、60min、90min、120min、150min和180min，酶解温度为90，固液比1:4，加酶量450u/g进行，测定大米蛋白提取率。4.2.1.5正交试验法优选淀粉酶法提取大米蛋白最佳工艺条件结合单因素试验所得结论，通过固液比、加酶量、酶解温度和酶解时间等单因素试验，选取较好的因素水平进行正交试验，其因素水平如下(表3一1)4.2.2糖基供体的筛选分别选择安赛蜜、甜蜜素、葡聚糖、与蛋白进行共价反应，以溶解度、分散度，持水性为考察指标，初步筛选出糖基供体。4.2.3米蛋白糖共价复合物的制备称取一定量蛋白，加去离子水使蛋白充分水化，用0.1 mol/L NaOH调pH至12，然后加热到50，磁力搅拌30 min，于室温下冷却，按一定配比以加入糖（总固形物含量2.5%w/v），搅拌30 min后用0.1 mol/L HCl调pH至9.5，再磁力搅拌30 min，最后进行冷冻干燥，得到蛋白/糖混合物的冻干粉25。将冷冻干燥好的样品置于装有饱和KBr溶液（相对湿度为79%）的干燥器内，反应控制在40进行。在不同反应时间分别取样，测定复合产物的性质。4.2.4.不同反应条件对共价复合物功能性质的影响工艺参数包括蛋白/糖质量比、相对湿度、温度、pH、作用时间等，以溶解性为考察指标，在单因素试验的基础上，通过正交试验，确定最优反应条件26。4.2.5.米蛋白糖复合物的分子组成与结构研究4.2.5.1电泳分析聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）4.2.5.2 氨基酸分析称取适量的蛋白质样品于10 mL的水解管中，然后加入6 mL的6 mol/L盐酸溶液进行酸水解，抽真空封管后，在1101水解24h以上，冷却后洗涤定容，过滤，蒸干。再加入0.02 mol/L的盐酸溶液在真空中放置30 min，用氨基酸自动分析仪进行氨基酸组成分析27。4.2.5.3表面疏水性测定采用ANS荧光探针法4.2.5.4高效液相色谱分析样品处理：将不同反应时间得到的样品液冷冻干燥，称取一定量的冻干样用0.05mol/L pH 9.0的缓冲液溶解（配制成0.1%w/v蛋白浓度的溶液），搅拌2 h，于7000 r/min下离心20 min，取上清液，用0.45m的微孔滤膜过滤，然后用微量注射器进样。流动相采用0.05 mol/L磷酸盐缓冲液（pH=9.0），溶解样品的溶剂为相同条件的磷酸盐缓冲液28。流速：1.00mL/min，温度：25。4.2.5.5荧光光谱最佳反应工艺条件下制备得到的蛋白糖反应液，用pH 8.5，0.2 mol/L硼酸盐缓冲液溶解，配置成蛋白浓度1 mg/mL的溶液，于7000 r/min离心20 min，取上清液，使用荧光分光光度计分别在347 nm(激发波长)进行发射波长扫描29。狭缝宽5 nm。4.2.5.6 红外光谱(FT-IR)分析准确称取适量干燥后样品（复合产物经30Kda超滤膜过滤5次后冻干，以除去未反应的糖及其他小分子物质），加入一定量的溴化钾，研磨成均匀粉末，压成薄片，再用傅立叶红外分光光度仪作全波长（400、40O0cm-1）扫描，扫描32次30。4.2.5.7电镜扫描图谱（SEM）分析采用扫描电镜观察：将冷冻干燥后的样品经研磨，过筛（80目）后在4下用2%(v/v)单宁酸和2.5%(v/v)戊二醛混合液固定，用磷酸缓冲液(pH7.2)漂洗；再用1%(v/v)饿酸固定，用磷酸缓冲液(pH7.2)漂洗；后经50%、70%、90%、100%(v/v)乙醇逐级脱水，用醋酸异戊醇置换出乙醇后，采用临界点干燥法进行干燥，经离子溅射喷金后，置于扫描电子显微镜(SEM)下观察、拍照31。4.2.6.米蛋白糖复合物的功能特性4.2.6.1溶解性的测定取5g样品于400ml烧杯中，量取200mL30的水，充分分散样品。于30水浴中，持续搅拌120min，转移至250ml容量瓶中，并定容。静置数分钟取上清液40ml置容积为50ml离心管中，1500r/min离心10min。吸取25ml上清液，测定蛋白质含量32。NSI值=水溶性氮/总氮100%4.2.6.2乳化性的测定采用Pearce的方法33，并稍加改进。取30 mL浓度为lmg/mL的待测样品溶液，溶于pH 7.0的0.1 mo/L的磷酸盐缓冲液中，加入10 mL大豆色拉油，在25下以12000r/min搅拌1 min，分别在0、1、3、5、10min取样，以1 mg/mL的SDS稀释100倍，测量500nm处的吸光值，以SDS溶液为空白。用0 min的乳浊度表示乳化活性，用5min后的乳浊度表示乳化稳定性。4.2.6.3 起泡性称取一定量复合物冷冻干燥样品，加0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH8），配制成0.8%w/v蛋白浓度的溶液20mL，在10000r/min下均质1min，立即记录泡沫总体积V0(mL)，以此代表起泡性，静置10min后，再次记录其泡沫体积V10(mL)，并计算其泡沫稳定性34。按下式计算起泡性及泡沫稳定性：起泡性%(FA)= V0 /20100 泡沫稳定性%（FS）= V10 / V01004.2.6.4粘度的测定粘度计4.2.7对修饰后的蛋白的物化特性研究4.2.7.1溶解性的测定将测试蛋白配制成质量分数为2%的水悬液，调节不同pH值于设定温度下搅拌1 h后，在3000 r/min转速下离心20 min，收集上清液，用Folin-酚试剂法测定其中蛋白质浓度35。蛋白溶解浓度（%）=(上清液中蛋白的克数/蛋白总克数) 1004.2.7.2水解度的测定采用pH-stat法3637。自加入酶制剂始，用pH计监视逐滴加入0.5 mol/LNaOH溶液以保持反应体系pH值不变，记录递加NaOH的时间和加入量。水解度的计算公式： DH（%）=(BNb/Mphhot) 100其中B碱液体积(ml)Nb碱液的摩尔浓度(mol/L)-氨基的解离度，10（pH-pK）/(1+10pH-pK)，其中pH是反应体系的pH值，pK是反应条件下-氨基酸解离常数(一般取7.0计算)MP底物中蛋白质总量(g)htot底物蛋白质中肽键总数(mmol/g蛋白质)，大米蛋白的hhot=7.7238。4.2.8.3米蛋白乳化性及乳化稳定性的测定乳化性及乳化稳定性的测定采用浊度法38。具体操作如下：以2%（质量分数）的大米蛋白溶液21ml，边搅拌边加入纯大豆色拉油9mL，然后以8000-10000r/min的速度高速匀浆1min制成乳状液，用微量注射器从底部抽取乳状液50L，放入试管中，与预先在试管中加5ml，0.1%(质量分数)的十二烷基硫酸钠(SDS)溶液混合制成混合液，在500nm的波长下测吸光值E0，该值为乳化活性指数(EAI)，再过10 min测吸光值Et，乳化稳定性指数(ESI)用以下公式计算： EST=(E0t)/(E0-Et)式中：E0为0min时测得的吸光值；Et为010min的吸光值之差；t为时间间隔。4.2.4.4米蛋白起泡性及起泡稳定性的测定39将测试蛋白配制成质量分数为2%的水悬液，调节不同pH值，取100ml放入250ml烧杯中，用高速分散器于10000r/min转速下搅拌2min，立即记录此时溶液上部泡沫体积（V0），静止30 min后再次记录泡沫体积（Vt）40。FS(%)=(V0/Vt) 100FS起泡稳定性，%；V0起泡能力（FA），ml；Vt泡沫体积，ml。5 试验进度安排2011.112011.12 米成分的测定及提取2012.012012.04 大米蛋白的糖基化改性研究2012.052012.07 糖基化大米蛋白的结构表征研究2012.082011.10 糖基化大米蛋白物化性质研究2012.112012.12 撰写论文6 预期达到的目标（1）确定淀粉酶法提取大米蛋白的最优条件。（2）筛选出糖基化改性的最佳糖基供体，得出改性的最佳工艺条件。（3）得出改性谷蛋白功能特性变化。7为完成课题已具备所需的条件及经费目前已收集到了大量的相关文献资料，和哈尔滨商业大学食品工程学院所拥有的仪器设备基本满足课题所需。实验需经费充足，用于实验材料、试剂、指标检测及外委检测等。8 预计研究过程可能遇到的困难和问题以及解决的措施在实验过程中，将面临一些问题，例如亚临界水设备可能需要在校外合作完成。并且高变性米中蛋白不易提取，与米相比，提取量要少很多，而且可能会有一些难以预料的困难，希望能够得到各位老师的帮助。相信在导师的指导和各位老师的帮助下能够顺利完成实验。9 参考文献1. 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