（精选幻灯片）05-new分子生物学研究方法.ppt

分子生物学研究法 1 分子生物学技术体系 一 基本技术二 基因 狭义 及产物分子检测技术三 基因 狭义 及产物获取技术四 基因 广义 功能研究技术 2 一 基本技术 1 琼脂糖凝胶电泳2 SDS PAGE电泳PCR技术细菌转化 3 1 琼脂糖凝胶电泳 1 原理 2 用途 4 琼脂糖凝胶电泳的原理 1 DNA电泳迁移 电荷效应 分子筛效益 1 DNA带负电 电场中 向正极移动 2 决定移动速度三因素 DNA大小 电荷数 构型 3 线性DNA分子移动速度与其分子质量的对数成反比 分子量越大 跑得越慢 2 检测原理 1 溴化乙锭 EB 可插入双链DNA分子中 在紫外光照射下 发射荧光 5 琼脂糖凝胶电泳用途 1 DNA分子量测定 距离 分子量 2 基因 克隆的鉴定 通过1完成 3 不同长度的基因片断的分离4 DNA浓度的测定 荧光的强度与DNA含量成正比 6 加标准分子量DNAMarker 测定分子量加标准浓度的DNA 测定浓度 7 2 SDS PAGE电泳 1 原理2 用途 8 SDS PAGE电泳原理 1 SDS 带负电 和还原剂破坏蛋白的高级结构 同时SDS与蛋白定量结合 消除蛋白之间的电荷差异 使得蛋白的迁移率主要依赖分子量 分子小跑得快 2 不连续电泳 上层为浓缩胶 可将样品压缩到同一起跑线 下层为分离胶 可获得更高的分辨率 3 考马斯亮蓝进行染色 9 10 11 SDS PAGE电泳用途 1 蛋白分子量的测定2 蛋白浓度的测定3 蛋白的鉴定 通过1来实现 12 3 PCR 聚合酶链式反应 技术 PCR的基本原理变性 复性 半保留复制PCR三步曲变性90 97 退火45 55 延伸72 13 PCR 14 4 细菌转化 通常情况下 外源基因无法进入细菌细胞内 当用电击法 或CaCl2 或RuCl等方法处理后 细胞膜的通透性发生变化 成为能容许外源基因进入的感受态细胞 感受态细胞的活性较低 处理需温柔 15 二 基因 狭义 及产物分子检测技术 定性 定量 定位 1 DNA 分子量和序列 1 酶切 电泳 2 PCR 3 Southernblot 4 染色体原位杂交 5 测序 2 RNA 序列 1 RT PCR 2 Northernblot 3 RNA原位杂交 4 DNA芯片技术 5 基因表达系列分析技术 SAGE 3 蛋白 分子量 结合特性 酶学特性 1 SDS PAGE 2 质谱技术 3 Westernblot 4 ELISA 5 蛋白芯片技术 6 免疫组化 7 EMSA 8 免疫共沉淀技术CoIP 9 蛋白质磷酸化分析 16 Southernblot DNA检测 17 Southernblot Southernblot 18 原位杂交技术 通过标记的核酸探针 在组织 细胞 间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段 1 RNA原位杂交 组织切片中 该基因的表达产物 mRNA 在细胞水平上作出定性定量分析 区别免疫组化 蛋白 2 染色体原位杂交 eg 荧光原位杂交 FISH 确定DNA序列染色体上的位置 DNA RNA检测 19 20 双脱氧法测序 Dudeoxysequenceanalyses 双脱氧法又称末端终止法 用于单链测序1 原理 Atkinson发现用DNApol合成DNA时如在反应物中加入一定量的2 3 ddTTP时 因ddT的3 碳原子不含 OH 故DNA不能延伸 1982年Sanger利用此原理建立了双脱氧测序法 原理和加减法相似 但不再是加一种dNTP或减一种dNTP 而是加入某一种双脱氧核苷 来终止聚合反应 用此法测得G4含5577bp DNA检测 21 22 23 Northernblot RNA检测 24 生物芯片技术 生物芯片是八十年代末在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术 它主要是指通过微加工技术和微电子技术在固格体芯片表面构建的微型生物化学分析系统 以实现对细胞 蛋白质 DNA以及其他生物组分的准确 快速 大信息量的检测 DNA RNA Protein检测 25 主要特点 高通量 微型化和自动化 芯片上集成的成千上万的密集排列的分子微阵列 能够在短时间内分析大量的生物分子 使人们快速准确地获取样品中的生物信息 效率是传统检测手段的成百上千倍 但目前的成本较高 重复性较差 26 生物芯片分类 1 用途 1 样品制备芯片2 生化反应芯片 如PCR芯片 3 检测芯片 如基因芯片 蛋白芯片 4 芯片实验室 是生物芯片技术发展的最终目标 它将样品的制备 生化反应到检测分析的整个过程集约化形成微型分析系统 27 生物芯片分类 2 制造技术 28 基因表达系列分析技术 SAGE 以测序为基础的定量分析全基因组表达模式的技术 能够直接读出任何一种类型细胞或组织的基因表达信息 理论依据 碱基的核酸片段可代表一种转录产物的特异序列 序列标签 某序列标签占总标签数的比例对应编码基因的表达频率 RNA检测 29 30 MS质谱技术 质谱技术的基本原理是样品分子离子化后 根据不同离子间质荷比 m z 的差异来分析蛋白质和多肽的分子量和对蛋白质进行鉴定 磷酸化蛋白质分析 糖基化蛋白质分析等 也能检测核酸的SNP Protein DNA检测 31 MALDI TOF和ESI MS MALDI基质辅助激光解吸离子化是将样品均匀包埋在固体基质中 基质吸收激光提供的能量而蒸发 携带部分样品分子进入气相 并将一部分能量传递给样品分子使其离子化 这种质谱仪的特点是可分析分子量较大的分子 对杂质的忍耐性较好 ESI 电喷雾质谱仪 通过样品溶液在毛细管喷雾口形成液滴 在强电场和热的干燥气的共同作用下 液滴逐渐被气化 同时也被质子化 喷雾口与离子聚焦传输区之间的压力差推动质子化样品进入质量分析器进行检测 32 MALDI TOFMS分析21 aa肽 理论分子量2404 33 Westernblot Protein检测 34 ELISA Protein检测 35 EMSA 凝胶阻滞试验 electrophoreticmobilityshiftassay 体外分析DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术 原理 非变性电泳中 核酸蛋白结合后 泳动速度变慢 DNA与Protein相互作用检测 36 37 免疫共沉淀技术 CoIP 蛋白 蛋白相互作用常验证酵母双杂交的结果 Protein protein相互作用的检测 38 蛋白质磷酸化分析 蛋白磷酸化是一种重要的细胞信号调控方式一般在丝氨酸 苏氨酸和酪氨酸上磷酸化 蛋白激酶 磷酸化 蛋白质磷酸酯酶 去磷酸化 一般通过双向电泳和质谱分析 也可通过磷酸化抗体Westernblot检测 Protein检测 39 三 基因 狭义 及产物获取技术 1 已知基因酶切 PCR或RT PCR获得基因 通过常规分离纯化技术或通过基因工程进行克隆和表达基因产物 2 未知新基因RACE技术cDNA文库酵母双杂交酵母单杂交噬菌体展示技术cDNA差示显示法双向电泳 质谱 数据库技术 40 一 重组DNA技术概论 41 3 1RACE技术 RapidamplificationofcDNAends已知基因一端序列 快速获取另一端序列 5 RACE 获取5 序列 3 RACE 获取3 序列 需要合成引物接头 单链DNA 用RNAligase将基因 RNA 与引物 DNA 连接 42 5 RACE 43 3 RACE 非mRNA扩增 合成两条互补的引物 序列任意 及一条序列特异的引物互补引物中一条5 标记Pi 通过RNAligase将其与RNA连接 44 45 2 3cDNA文库 cDNA 1 将mRNA反转录为双链DNA 2 特点 A 稳定 B 无内含子 二 cDNA文库 1 代表了生物体某一器官或者组织mRNA中所含的全部或绝大部分遗传信息 2 特点 A 不同的生物 同一生物不同组织 同一组织不同发育时间或不同生理状态下 cDNA文库不同 B 建好的cDNA文库的具体的信息未知 仅提供钓取相关目的基因的材料 C 每个克隆不一定是全长基因 46 cDNA文库建库过程 1 高质量mRNA的制备 2 反转录生成cDNA3 与载体分子连接 噬菌体文库 4 转染 噬菌体的包装 47 48 说明 引物oligodT 随机引物R6 得到全长cDNA 两端可加上酶切接头 便于克隆到载体上 合成时 原料用甲基化的dCTP 防止酶切时损伤内部序列 转化效率要高 防止少量表达的mRNA未得到克隆 49 酵母双杂交法 蛋白 蛋白相互作用 1 筛选与已知蛋白相互作用的蛋白基因2 真核生物的转录激活子基本结构一般有3个功能域 functionaldomain DNA结合域 DNA bindingdomain DB转录激活域 transcription activatingdomain AD结合其它蛋白或因子的结构域 50 51 52 猎物 为一个库 将不同的 诱饵 克隆后 捕获不同的 猎物 53 5酵母单杂交 核酸 蛋白相互作用 用于鉴定与特定顺式作用元件 DNA序列 作用的转录调控因子的DNA结合域 或反之 54 55 噬菌体展示技术 蛋白 蛋白相互作用将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达 从而使多肽能够展示在病毒颗粒的表面 展示在噬菌体表面的多肽配体与各种靶分子 抗体 酶 细胞表面受体等 通过一种被称为淘选的体外选择程序得以快速筛选鉴定 噬菌体展示技术构建的文库容量大 可进行多次 淘选 富集 十分适用于高通量筛选 因此可以广泛应用于蛋白质相互作用分析等方面的研究 也是进行多肽药物筛选的重要手段 56 57 双向电泳 双向电泳是蛋白质组学中对蛋白质组进行研究的主要分离方法 同时能分离成百上千种蛋白质 蛋白质在第一向根据电荷的不同 等电聚焦 第二向根据分子量的不同进行分离 SDS PAGE 分离后对蛋白质进行染色 根据实际分析情况 分别进行考马斯亮兰染色 银染或荧光染色 扫描后用相关软件 PDQUEST等 进行图谱分析 分析差别点等 双向电泳与质谱技术联用 还可以进一步分析差别点蛋白的特性 58 59 四 基因 广义 功能研究技术 调控元件功能和表达产物的功能 定点突变技术基因打靶RNAi技术转基因过表达技术报告基因技术 60 定点突变 1 研究某个氨基酸残基对蛋白质的结构 功能的影响 2 改造DNA调控序列 修饰表达载体 引入新的酶切位点 基因功能研究技术 61 TaKaRamutationkit 62 基因打靶 genetargeting 通过DNA定点同源重组 改变基因组中的某一特定基因 在生物活体内研究该基因的功能 反向遗传学 基因敲除 geneknockout 定向敲除基因敲入 geneknockin 定向替代 基因功能研究技术 63 基因打靶的必备条件 胚胎干细胞 ES细胞 能在体外培养 保留发育的全能性打靶载体Neo 新霉素 阳性筛选标志HSV tk阴性筛选标志 单纯疱疹病毒 herpessimplexvirus 胸腺嘧啶激酶 thymidinekinase 64 基因敲除的基本程序 打靶载体的构建打靶载体导入ES细胞 重组置换基因敲除ES细胞注射入胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宫中嵌合体的杂交育种 65 66 基因敲除Knockout 1 完全基因敲除