生物药物分析与检测 高效液相色谱法.ppt

第六章 高效液相色谱法 1 第一节概述第二节基本理论第三节高效液相色谱的定性和定量分析第四节实际操作中的问题第五节在药物分析中的应用 高效液相色谱法 2 3 1 历史 1903年茨维特分离绿叶色素 Tswett实验 40年代TLC 纸色谱50年代GC出现使色谱具备分离和在线分析功能60年代末HPLC出现 使色谱分析范围进一步扩大2 展望 1 新型固定相和检测器2 联用仪器 GC MS HPLC MS3 智能化发展 第一节概述 4 Tswett实验 5 茨维特的实验 图示 6 色谱三要素 固定相 流动相 待分离物质 Tswett实验 7 经典液相色谱法 柱层析 8 高效液相色谱法 highperformanceliquidchromatography HPLC 是在经典液相色谱法的基础上 引入了气相色谱的理论与高压技术 以高压输送流动相 采用高效固定相及高灵敏度检测器 发展而成的现代液相色谱分离分析方法 二 什么是HPLC 9 概述高效液相色谱 HPLC 是以溶剂液体为流动相的色谱方法 早期液相色谱 包括Tswett的工作 都是在直径1 5cm 长50 500cm的玻璃柱中进行的 为保证有一定的柱流速 填充的固定相颗粒直径多在150 200 m范围内 即使这样 流速仍然很低 1mL min 分析时间仍然很长 当加压增加流速 真空或空气泵 时 尽管分析时间减少 但柱塔板高度Hmin也相应增加了 或者说柱效下降了 为了解决分析时间及柱效问题 人们认识到 最为有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径 3 10 m 直到60年代 由于在高压下操作的液压设备 高效固定相以及高灵敏检测器的出现及发展 才彻底解决了分析时间及柱效的问题 即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用 10 HPLC与经典LC区别 11 HPLC与经典LC区别 主要区别 固定相差别 输液设备和检测手段 12 HPLC与GC差别 相同 兼具分离和分析功能 均可以在线检测主要差别 分析对象的差别和流动相的差别 1 分析对象GC 能气化 热稳定性好 且沸点较低的样品 高沸点 挥发性差 热稳定性差 离子型及高聚物的样品不可检测占有机物的20 HPLC 溶解后能制成溶液的样品 不受样品挥发性和热稳定性的限制分子量大 难气化 热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测用途广泛 占有机物的80 13 2 流动相差别GC 流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力 只与固定相作用HPLC 流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力 为提高柱的选择性 改善分离度增加了因素 对分离起很大作用流动相种类较多 选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性 3 操作条件差别GC 加温操作HPLC 室温 高压 液体粘度大 峰展宽小 14 HPLC的特点和应用 三高 一快 一广 高柱效 远高于一般LC高灵敏度高选择性分析速度快应用范围广泛 可分析80 有机化合物 15 建立高效液相色谱分析方法 根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种高效液相色谱分析方法 选择一根适用的色谱柱 确定柱的规格 柱内径及柱长 和选用固定相 粒径及孔径 选择适当的或优化的分离操作条件 确定流动相的组成 流速及洗脱方式 由获得的色谱图进行定性分析和定量分析 16 高效液相色谱方法开发与色谱条件优化 17 18 由于HPLC分析不受温度和样品沸点限制 因此具有更广阔的应用潜力 经过30多年的迅速发展 高效液相色谱法在基础理论 仪器装置和色谱柱等方面的研究已趋于成熟 现已成为化学化工 环境 药学 食品等多个领域中最具优势的分离分析方法之一 第19页 共49页 19 HPLC常见机型 WatersLC 600WatersLC 2690岛津LC 10AHP1050Agilent1100系列 20 液相色谱仪 1 21 液相色谱仪 2 22 液相色谱仪 3 23 液相色谱仪 4 24 液相色谱仪 5 Agilent1100系列 25 储液瓶 高压泵 进样器 色谱柱 检测器 废液 一 高效液相色谱仪结构流程 高压输液泵 高效分离住 高灵敏度检测器 26 典型的仪器配置 Back 27 HPLC系统 28 一高压输液系统1 贮液器 1 2L的玻璃瓶 配有溶剂过滤器 Ni合金 其孔很约2 m 可防止颗粒物进行泵内 2 脱气 超声波脱气或真空加热脱气 溶剂通过脱气器中的脱气膜 相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去 3 高压泵 对输液泵的要求 密封性好 输液流量稳定无脉动 可调范围宽 耐腐蚀 29 要求 输出压力高 平稳 脉冲小 流量稳定可调 耐腐蚀 机械往复柱塞泵结构图 30 4 梯度淋洗装置 梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例 从而使流动相的强度 极性 pH值或离子强度相应地变化 达到提高分离效果 缩短分析时间的目的 如果只有一个泵 可采用低压混合设计 将两种或以上的溶剂按一定比例混合 再由高压泵输出 如果有两个或以上泵 调节各自的流量 在高压下混合 31 在液相色谱中 可以通过改变流动相的组成 极性来改善分离和调节出峰时间 32 两台高压输液泵 将两种不同极性的溶剂按一定比例送入混合器 混合后进入色谱柱 一台高压泵 通过比例调节阀 将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入混合器中混合 高压梯度 外梯度 低压梯度 内梯度 33 通过改变流动相的组成来调整组分的k值 改变分离因子 值 以达到最短时间内得到最佳分离的目的 梯度洗脱 梯度洗脱的特点 改善分离 加快分析速度 改善峰形 减少拖尾 可能引起基线漂移 34 分离和进样系统 一 进样系统与GC相比 HPLC柱要短得多 因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些 即 HPLC的展宽多因一些柱外因素引起 这些因素包括 进样系统 连接管道及检测器的死体积 进样装置包括两种 1 隔膜注射进样 使用微量注射器进样 装置简单 死体积小 但进样量小且重现性差 35 2 高压进样阀 目前最常用的为六通阀 由于进样量可由样品管控制 因此进样准确 重复性好 如图 36 仪器 手动进样器 六通阀 定量环 六通阀定量环 通废液口 进柱 定量环 第37页 共49页 37 仪器 自动进样器 自动进样100样品盘 机器手 自动洗针 机械手 样品盘 第38页 共49页 38 色谱柱 柱温箱 色谱柱外挂架 柱温箱 外挂架 第39页 共49页 39 内径 1 6mm 柱长 5 50cm 柱填料粒径 5 10 m 为保护色谱柱 通常在柱前加一支填料与色谱柱相同的保护柱 分离系统 色谱柱 40 二 色谱柱由柱管与固定相组成 柱管多用不锈钢制成 管内壁要求具有很高的光洁度 固定相采用匀浆法高压 80 100MPa 装柱 色谱柱按规格不同分为分析型与制备型两类分析型柱常量柱 内径2 4 6mm 柱长10 25cm 半微量柱 内径1 1 5mm 柱长10 20cm实验室制备型柱 内径20 40mm 柱长10 30cm 41 色谱柱柱效的评价柱性能指标包括在一定条件下 试样 流动相 流速 温度 下的柱压 理论塔板高度H和理论塔板数n 对称因子f 容量因子k和选择性因子的重复性 或分离度R 分析样品时 需检验柱性能是否合乎要求 42 常用色谱柱柱效评价条件如下 硅胶柱样品 苯 萘 联苯及菲 用己烷配制 流动相 无水己烷 反相色谱柱 ODS柱等 样品 尿嘧啶 测死时间用 硝基苯 萘及芴 或甲醇配制的硅胶柱样品 流动相 甲醇 水 85 15 乙腈 水 60 4O 43 正相色谱柱 氰基与氨基柱等 样品 四氯乙烯 测死时间用 邻苯二甲酸二甲酯 邻苯二甲酸二正丁酯及肉桂醇 也可用偶氮苯 氧化偶氮苯及硝基苯为样品 流动相 正庚烷按上述条件 测得各组分的W1 2 及tR 求出理论塔板数n及相邻组分的分离度R l 5 44 色谱柱柱效指标填料粒径为3 m 4 m 5 m 7 m或10 m时 柱效应分别大于8万 6万 5万 4万及2 5万理论塔板数 米 或用m 1表示 45 色谱柱的再生反相色谱柱以甲醇一水 95 5 纯甲醇及一氯甲烷等为流动相 依次冲洗 顺序不得颠倒 每种流动相的冲洗体积应20倍于柱体积 然后 再以相反顺序依次冲洗 正相色谱柱 含硅胶柱 以严格脱水的正己烷 异丙醇 一氯甲烷及甲醇为流动相 依次冲洗 顺序不得颠倒 其它步骤同上 46 三 检测系统要求 灵敏度高 噪声低 线性范围宽 重复性好 适用性广等 应用最多的是紫外检测器 UVD 其次是荧光检测器 FD 与电化学检测器 ECD 示差折光检测器 RID 虽是泛用型检测器 因受温度影响较大 灵敏度不够高 除还用于糖类的检测外 已少用 新型蒸发光散射检测器及发光检测器是有发展前途的检测器 47 仪器 检测器 紫外 UV Vis双灯 全波长检测 检测器 流路 第48页 共49页 48 一 紫外检测器 UVD或UV HPLC分析中因此该类检测器应用很广 原理样品组分通过流通池时对特定波长紫外线的吸收与浓度成正比 检测系统由光源 流通池 检测元件 微机及记录器等组成 49 基本原理 试样组分对特定波长的紫外光具有选择性的吸收 吸光度与试样组分浓度之间的定量关系符合郎伯 比耳定律 优点 灵敏度高 线形范围宽 死体积小 波长可选 对流速和温度变化不敏感 可用于梯度洗脱 缺点 无紫外 可见吸收组分不响应 流动相选择受一定限制 50 常用纯溶剂的截止波长 水190 乙腈190 甲醇205 正己烷210 乙醚220 四氢呋喃225 二氯甲烷245 氯仿245nm 在选择测量波长时注意 溶剂必须能让所选择的光透过 即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长 截止波长 51 特点 灵敏度高 噪音低 最小检出量可达10 12g 不破坏样品 能与其它检测器串联 对温度及流速波动不敏感 可用于梯度淋洗 属浓度型检测器 弱点 只能检测有紫外吸收的样品 流动相的选择有一定限制 52 紫外吸收检测器的类型分为 固定波长型 可变波长型及二极管阵列检测器三种 1 固定波长检测器是光源波长固定的光度计 一般波长为254nm 相当于定波长紫外光度计 因波长不能调节 不能选择在最佳吸收波长下检测 已基本淘汰 53 2 可变波长型检测器是一台紫外 可见分光光度计或紫外分光光度计 波长可按需要选择 是HPLC配置最多的检测器 其光学结构与一般紫外分光光度计一致 主要区别是用流通池替代了比色池 通常其光程为2 10mm 体积约为1 10 L 54 3 光电二极管阵列检测器 PDAD 是80年代出现的新型紫外检测器 人们想测定通过流通池时各组分的光谱获得定性信息 但因组分停留时间太短 1秒 普通紫外分光光度计的扫描速度跟不上 若停留扫描则破坏了分离状态 而二极管阵列检测器用二极管阵列代替光电管 一般一个二极管对应接受光谱上一个纳米 nm 谱带宽度的单色光 可在全波长范围进行快速扫描 获得三维光谱一色谱图 同时得到定性 定量信息 55 二 荧光检测器 FD 早期的荧光检测器是具有滤光片的荧光光度计 已基本淘汰 目前使用的荧光检测器多是具有流通池的荧光分光光度计 直角光路 检测限可达1 10 10g ml 比紫外检测器灵敏 但只适用于能产生荧光或其衍生物能发荧光的物质 56 基本原理 在一定的条件下 荧光强度与流动相中的组分的浓度成之比 对多环芳烃 维生素B 黄曲霉素 卟啉类化合物 农药 药物 氨基酸 甾类化合物等有响应 57 特点 高灵敏度 高选择性 可用于梯度洗脱 58 主要用于氨基酸 多环芳烃 维生素 甾体化合物 酶类 黄曲霉素 卟啉类化合物 农药等的检测 59 三 示差折光检测器 通用型检测器 基本原理 连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光系数差值 该值与试样池流动相中的组分浓度成正比 每种物质具有不同的折光指数 生命科学中各类糖类化合物 没有紫外吸收 一般要用示差折光检测器 60 缺点 灵敏度低 对温度敏感 不能用于梯度洗脱 61 四 蒸发光散射检测器 ELSD 是90年代出现的最新型的泛用检测器 可用于挥发性低于流动相的任何样品组分的检测 主要用于糖类 高分子化合物 高级脂肪酸及甾体类等 还可用于凝胶色谱及超临界流体色谱的检测 62 原理 将流出色谱柱的流动相及组分先引入通载气 高纯N2 的蒸发室 加热 使流动相蒸发除去 组分则形成气溶胶 被载气带入检测室 用激光或强光照射气溶胶而产生散射光 丁锋尔光效应 测定散射光强而获得组分的浓度信号 散射光强I与进入检测器的气溶胶中组分质点的 质量和 m的关系为 I kmbk b是二个与实验条件有关的常数 63 64 仪器 化学工作站 进样器 高压泵 流动相 色谱柱 检测器 数据处理 第65页 共49页 65 液相色谱根据分离机理的不同可分为 液固吸附色谱 液液分配色谱离子交换色谱离子对色谱法 分子排阻色谱 或凝胶渗透色谱 第66页 共49页 第二节基本理论 66 一 液 固吸附色谱 流动相 各种不同极性的一元或多元溶剂 固定相 固体吸附剂 如硅胶 氧化铝等 颗粒度较小 5 10 m 分离机理 流动相中的溶质分子 X 与溶剂分子 S 在固体吸附剂上竞争吸附的结果 67 下标M s分别代表流动相和固定相 n代表被吸附的溶剂分子数 K代表吸附平衡常数 吸附平衡常数K不等于分配系数 K值越大 保留时间越长 分配系数大 适用对象 相对分子质量中等的油溶性试样 对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性 68 流动相和固定相都是液体的色谱法即为液 液色谱 是利用样品组分在两种不相溶的液相间的分配来进行分离 一种液相为流动相 另一种是涂于载体上的固定相 流动相极性小于固定相极性的液 液色谱法称为正相分配色谱法 流动相极性大于固定相极性的液 液色谱法称为反相分配色谱法 第69页 共49页 二 液 液分配色谱 69 固定相与流动相均为液体 互不相溶 基本原理 组分在固定相和流动相上的分配 与气相色谱中气 液色谱比较 改变流动相的组成来改善分离效果 K不仅与固定相的种类有关 也与流动相的种类有关 70 正相分配色谱 正相柱 组分极性越大 保留时间越长 使用极性化合物的分离 反相分配色谱 反相柱 组分极性越小 保留时间越长 适用非极性化合物的分离 71 将固定液的官能团键合在载体的表面 而构成化学键合相 以化学键合相为固定相的色谱法称为化学键合相色谱法 简称键合相色谱法 BPC 三 化学键合相色谱 72 固定相非常稳定 在使用中不易流失 由于可将各种极性的官能团键合到载体表面 因此它适用于种类繁多样品的分离 特点 将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶 担体 表面的游离羟基上 73 1 键合固定相制备 ODS C18 键合相 硅胶 十八烷基氯硅烷 非极性 硅烷化反应 使用pH范围 2 8 74 2 键合固定相类型 类型 反相柱 正相柱 氨丙基氰乙基 醚和醇等极性基团 不同碳原子数的烷烃 C8和C18 苯基等疏水基团 75 保留时间 例 以ODS键合色谱柱 甲醇 水为流动相分离以下两种苯甲酸 试判断出峰次序 没食子酸 3 4 二羟基苯甲酸 固定相 非极性 流动相 极性组分极性 3 4 二羟基苯甲酸 没食子酸 76 一 正相键合色谱法 1 分离机制 分配过程 组分在两相间进行分配 极性强的组分分配系数大吸附过程 溶质分子与固定相之间定向作用力诱导力 或氢键作用力2 固定相 极性大的氰基或氨基键合相3 流动相 极性小 同LSC 底剂 有机极性调节剂例 正己烷 氯仿 甲醇 氯仿 乙醇 77 4 流动相极性与k的关系 流动相极性 洗脱能力 组分tR k 5 出柱顺序 结构相近组分 极性小的组分先出柱 极性大的组分后出柱 6 适用 分析极性大物质 糖类等 78 二 反相键合相色谱 1 分离机制 疏溶剂理论把非极性的烷基键合相 看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的 分子毛 这种 分子毛 有强的疏水特性 当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时 一方面 非极性组分分子或组分分子的非极性部分 由于疏溶剂的作用 将会从水中被 挤 出来 与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用 79 另一方面 被分离物的极性部分受到极性流动相的作用 使它离开固定相 减少保留值 此即解缔过程 这两种作用力之差 决定了分子在色谱中的保留行为 80 保留机制疏溶剂理论 solvophobictheory 溶质的保留主要是溶质分子与极性溶剂分子间的排斥力 促使溶质分子与键合相的烃基发生疏水缔合 不是溶质分子与键合相间的色散力 81 2 固定相 极性小的烷基键合相C8柱 C18柱 ODS柱 3 流动相 极性大的甲醇 水或乙腈 水流动相极性 固定相极性底剂 有机调节剂 极性调节剂 例 水 甲醇 乙腈 THF 82 4 保留行为的影响因素 1 溶质的分子结构 溶质极性 疏水性 k 组分tR 2 流动相极性与k的关系 流动相极性 洗脱能力 k 组分tR 3 固定相 碳链 疏水性 k 组分tR 5 出柱顺序 极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱6 适用 非极性 中等极性组分 HPLC80 问题 83 正相和反相键合色谱法 在HPLC分析中 有时要在流动相中加入适量的盐 碳酸铵 四烷基铵盐 或酸 为什么 答 都是为了防止峰形拖尾 加入盐类是为了减少待测物与键合相表面的残留硅醇基作用 加入酸是抑制酸类待测物的离解 使其以游离酸在柱内分离 84 固定相与流动相 反相HPLC极性 固定相 流动相固定相 极性弱流动相 甲醇 乙腈等 极性强极性小物质后出峰 正相HPLC极性 固定相 流动相固定相 极性强流动相 己烷 庚烷 极性弱极性物质后出峰 与固定相极性相近tR长 主流 第85页 共49页 85 流动相 反相 常用溶剂 乙腈 甲醇 水等 实际使用 甲醇 水 乙腈 水混合体系 等度洗脱 流动相比例恒定梯度洗脱 逐步提高有机溶剂比例 第86页 共49页 86 87 四 离子交换色谱 固定相 阴离子交换树脂或阳离子交换树脂 阳离子 SO3H 强 CO2H 弱 阴离子 N R3 强 NH2 弱 担体 苯乙烯 二乙烯苯共聚物微球 键合基团 键合 88 流动相 阳离子交换树脂固定相 采用酸性水溶液 阴离子交换树脂固定相 采用碱性水溶液 基本原理 试样组分在固定相上发生的反复离子交换反应 依据组分与离子交换剂之间亲和力的不同而分离 89 阳离子交换 R SO3H M R SO3M H 阴离子交换 R NR4OH X R NR4X OH 一般形式 R A B R B A 试样组分与交换基团间的作用力的大小决定色谱的保留行为 90 阳离子交换 R SO3H M R SO3M H 阴离子交换 R NR4OH X R NR4X OH 组分与离子交换剂之间作用力的大小与离子半径 电荷 存在形式等有关 作用大 保留时间长 应用 离子及可离解的化合物 氨基酸 核酸 蛋白质等 91 五 离子对色谱 离子对色谱 用正向或反向色谱柱分离离子和中性化合物混合物的方法 离子对 两个相反电荷的离子相互作用形成一个中性化合物 92 原理 将一种 或多种 与溶质离子电荷相反的离子 对离子或反离子 加到流动相 固定相 中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物 使其能够在两相之间进行分配 93 由于待测离子的性质不同 与对离子形成离子对的能力不同 形成的离子对的疏水能力不同 在两相间的分配系数不同 从而实现色谱分离 阴离子分离 烷基铵类 如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子 阳离子分离 烷基磺酸类 如己烷磺酸钠作为对离子 94 六 空间排阻色谱 凝胶色谱 原理 利用凝胶中孔径大小的不同 按分子大小分离 小分子可以扩散到凝胶空隙 由其中通过 出峰最慢 中等分子只能通过部分凝胶空隙 中速通过 而大分子被排斥在外 出峰最快 溶剂分子小 故在最后出峰 快速分离不同分子量混合物的色谱方法 95 相对分子质量差别大于10 的化合物才可以分离 排阻色谱分离示意图 96 七 亲和色谱 原理 利用生物大分子和固定相表面存在的某种特性亲和力 进行选择性分离的一种色谱方法 具有反应活性的连接链 环氧 联胺等 酶 抗原等 97 第一节色谱图流出曲线及有关术语一 色谱流出曲线及色谱峰 一 色谱流出曲线 色谱图 chromatogram 是样品被流动相冲洗 通过色谱柱 流经检测器 所形成的浓度信号随洗脱时间变化而形成的曲线 称为色谱流出曲线 简称流出曲线 即浓度 时间曲线 动画 98 二 基线 baseline 1 基线 baseline 在正常操作条件下 仅有流动相通过时响应信号 时间曲线 2 基线噪声 baselinenoise 由各种因素所引起的基线波动 一般计算峰前后1 2min内的噪声 3 基线漂移 baselinedrift 基线随时间定向的缓慢移动 99 三 色谱峰 chromatographicpeak 1 正常色谱峰 呈正态分布2 拖尾峰 tailingpeak 前沿陡峭 后沿拖尾的不对称色谱峰3 前伸峰 leadingpeak 前沿平缓 后沿陡峭的不对称色谱峰 100 4 不对称度 As 或拖尾因子 T tailingfactor As 不对称因子 B A x 0 10h T 拖尾因子 A B 2A x 0 05h 101 Asymmetry Afactordescribingtheshapeofachromatographicpeak TheoryassumesaGaussianshapepeakthatissymmetrical Thepeakasymmetryfactoristheratio at10percentofthepeakheight ofthedistancebetweenthepeakapexandthebacksideofthechromatographiccurvetothedistancebetweenthepeakapexandthefrontsideofthechromatographiccurve Avalue 1isatailingpeak whileavalue 1isafrontingpeak 102 5 假峰 ghostpeak 又称鬼峰 由于仪器条件的变化等原因而在谱图上出现的色谱峰 即并非由试样所产生的峰 103 色谱峰 1个样品组分的色谱峰可用3个参数来描述 即峰高 或峰面积 峰位和峰宽 峰高 或峰面积 用于定量 峰位用于定性 峰宽可用于衡量柱效 若描述一组色谱峰 还需用分离参数表述相邻峰的重叠程度 104 二 保留值 定性参数 一 保留时间 retentiontime 1 死时间 deadtime tM 2 保留时间 retentiontime tR 3 调整保留时间 adjustedretentiontime tR tR tR tM 二 保留体积 retentionvolume 1 死体积 VM VM tM Fc 2 保留体积 VR VR tR Fc 3 调整保留体积 VR VR VR VM Fc 载气流速 mL min 105 1 死时间tM 一些不被固定相吸收或吸附的气体通过色谱柱时 从进样到出现峰极大值所需的时间 它正比于色谱柱的空隙体积 如用热导池作检测器时 从注射空气样品到空气峰顶出现时的时间 以s或min为单位表示 106 2 保留时间 tR 试样 某一组分 从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间为试样中某一组分的保留时间 以s或min为单位表示 107 3 调整保留时间 保留时间减去死时间即为调整保留时间 108 4 死体积 指色谱柱中不被固定相占据的空间及进样系统和到检测系统的总体积 当色谱仪中管路和连接头间的空间以及检测系统的空间的总体积很小而可忽略不计时 等于死时间乘以载气的流速 109 5 保留体积 从注射样品到经过柱后色谱峰顶出现时 通过色谱系统流动相的体积 一般可用保留时间乘载气流速求得 以mL为单位表示 110 6 调整保留体积 保留体积减去死体积即为调整保留体积 VR VM 111 三 相对保留值 r21 在一定色谱条件下被测组份2和组份1调整保留值之比 r21 t R2 t R1 V R2 V R1 式中t R2 组份2的调整保留时间 t R1 组份1的调整保留时间 它与流动相的流速和色谱柱的物理指标无关 仅与柱温和固定相的性质有关 112 四 保留指数 retentionindex t R x 待测物X的调整保留时间t R z 碳原子数为Z的正构烷烃的调整保留时间t R z n 碳原子数为z n的正构烷烃的调整保留时间t R z t R x t R z n 通常n 1 规定正构烷烃的I值是其原子数的100倍 如 正庚烷I 700 113 114 115 保留指数差 化合物x在某一固定液s上测得的保留指数减去在角鲨烷 异三十烷 固定液上得到的保留指数 116 一 区域宽度 用来衡量色谱峰宽度的参数 有三种表示方法 1 标准偏差 即0 607倍峰高处色谱峰宽度的一半 2 半峰宽 W1 2 色谱峰高一半处的宽度W1 2 2 354 3 峰底宽 W W 4 三 柱效参数 117 从色谱图中 可得许多信息 1色谱峰的个数 可推断所含组分的个数 2根据色谱峰的保留值 可以进行定性分析 3根据色谱峰的面积或峰高 可以进行定量分析 4色谱峰的保留值及其区域宽度 评价柱效依据 5色谱峰两峰间的距离判断组分选择性 118 一 分配系数 partitionfactor K在一定温度 压力下 组分在固定相和流动相中平衡浓度的比值 第三节色谱法基本原理 一 分配系数和分配比 相平衡参数 是用来描述色谱过程中 样品组分在相对运动的两相中的分配情况 动画 119 分配系数K的讨论 一定温度下 组分的分配系数K越大 出峰越慢 试样一定时 K主要取决于固定相性质 选择适宜的固定相可改善分离效果 试样中的各组分具有不同的K值是分离的基础 某组分的K 0时 即不被固定相保留 最先流出 同一条件下 若两组分的K值相等 则色谱峰重合 差别越大 色谱峰的距离越大 120 二 分配比 partionratio k或K 在实际工作中 也常用分配比来表征色谱分配平衡过程 分配比是指 在一定温度下 组分在两相间分配达到平衡时的质量比 1 分配系数与分配比都是与组分及固定相的热力学性质有关的常数 随分离柱温度 柱压的改变而变化 2 分配系数决定于组分和两相性质 与两相体积无关 而分配比与组分和两相性质有关 也两相体积有关3 分配系数与分配比都是衡量色谱柱对组分保留能力的参数 数值越大 该组分的保留时间越长 分配比也称 容量因子 capacityfactor 容量比 capacityfactor 121 三 分配比与分配系数的关系 式中 为相比 填充柱相比 5 35 毛细管柱的相比 50 1500 VM为流动相体积 即柱内固定相颗粒间的空隙体积 VS为固定相体积 对不同类型色谱柱 VS的含义不同 气 液色谱柱 VS为固定液体积 气 固色谱柱 VS为吸附剂表面容量 122 四 分配比与保留时间的关系 tR tM 1 k tR ktM 123 五 分配比 分配系数与选择性因子的关系 a t R 2 t R 1 k2 k1 K2 K1 124 讨论 如何使A B组分完全分离 1 两组分的分配系数必须有差异2 区域宽度的扩展速度应小于区域分离的速度3 在保证快速分离的前提下 提供足够长的色谱柱 125 练习题 1 混合样品a b c d e在柱上的分配系数分别为105 85 310 50 205 则各个组分流出柱的先后顺序为 Ad b a e cB c d a b eC c e a b dD a b c d e 126 下列参数改变时 会引起分配系数变化的是 A柱长增加B 固定相改变C 相比减少D 流动相流速增加下列参数改变时 会引起分配比变大的是 A柱长增加B 固定相改变C 相比减少D 流动相流速增加 127 色谱理论需要解决的问题 色谱分离过程的热力学和动力学问题 影响分离及柱效的因素与提高柱效的途径 柱效与分离度的评价指标及其关系 组分保留时间为何不同 色谱峰为何变宽 组分保留时间 色谱过程的热力学因素控制 组分和固定液的结构和性质 色谱峰变宽 色谱过程的动力学因素控制 两相中的运动阻力 扩散 两种色谱理论 塔板理论和速率理论 128 塔板理论的假设 1 在每一个平衡过程间隔内 平衡可以迅速达到 2 将载气看作成脉动 间歇 过程 3 试样沿色谱柱方向的扩散可忽略 4 每次分配的分配系数相同 5 所有物质在开始时全部进入零号塔板 二 塔板理论 1 塔板理论 platetheory 半经验理论 将色谱分离过程比拟作蒸馏过程 将连续的色谱分离过程分割成多次的平衡过程的重复 类似于蒸馏塔塔板上的平衡过程 129 组分在n 5 k 1 m 1柱内任一板上分配表 130 色谱柱长 L 虚拟的塔板间距离 H 色谱柱的理论塔板数 n 则三者的关系为 n L H理论塔板数与色谱参数之间的关系为 保留时间包含死时间 在死时间内不参与分配 131 2 有效塔板数和有效塔板高度 单位柱长的塔板数越多 表明柱效越高 用不同物质计算可得到不同的理论塔板数 组分在tM时间内不参与柱内分配 需引入有效塔板数和有效塔板高度 132 二 塔板数和塔板高度 柱效 也叫柱效能理论塔板数n有效塔板数neff理论塔板高度HH L n有效塔板高度HeffHeff L neff 133 得出色谱流出曲线方程 C0 进样的浓度tR 保留时间 标准偏差 134 较好地解析了色谱曲线形状2浓度极大点Cmax的位置是tR 即VR 3计算评价柱效 塔板理论成功之处 135 塔板理论不足之处不能解析载气流速u对N影响不能指出板高H受那些因素影响 136 3 塔板理论的理解 1 当色谱柱长度一定时 塔板数n越大 塔板高度H越小 被测组分在柱内被分配的次数越多 柱效能则越高 所得色谱峰越窄 2 不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同 用有效塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时 应指明测定物质 3 柱效不能表示被分离组分的实际分离效果 当两组分的分配系数K相同时 无论该色谱柱的塔板数多大 都无法分离 4 塔板理论无法解释同一色谱柱在不同的载气流速下柱效不同的实验结果 也无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途径 137 三 速率理论 影响柱效的因素 一 范 弟姆特 VanDeemter 方程式 气相色谱速率理论H A B u C uH 理论塔板高度 u 载气的线速度 cm s 减小A B C三项可提高柱效 存在着最佳流速 A B C三项各与哪些因素有关 138 A 涡流扩散项 eddydiffusion A 2 dpdp 固定相的平均颗粒直径 固定相的填充不均匀因子 固定相颗粒越小dp 填充的越均匀 A H 柱效n 表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻 色谱峰较窄 动画 139 B u 分子扩散项moleculardiffusion B 2 Dg 弯曲因子 填充柱色谱 1 Dg 试样组分分子在气相中的扩散系数 cm2 s 1 1 存在着浓度差 产生纵向扩散 2 扩散导致色谱峰变宽 H n 分离变差 3 分子扩散项与流速有关 流速 滞留时间 扩散 4 扩散系数 Dg M载气 1 2 M载气 B值 动画 140 k为容量因子 Dg DL为扩散系数 dp 固定相的平均颗粒直径 df液膜的厚度 减小担体粒度 选择小分子量的气体作载气 降低固定相液膜厚度 可降低传质阻力 C u 传质阻力项 传质阻力包括气相传质阻力Cg和液相传质阻力CL即 C Cg CL 动画 141 二 范氏方程讨论 1 颗粒大小与粒度范围 1 颗粒太大 填充均匀性越差 2 dP太小气阻大 固定相颗粒直径一般40 60 60 80 80 100目 A 2 dp 142 2 载气流速与柱效 最佳流速 载气流速高时 传质阻力项是影响柱效的主要因素 流速 柱效 载气流速低时 分子扩散项成为影响柱效的主要因素 流速 柱效 H u曲线与最佳流速 由于流速对这两项完全相反的作用 流速对柱效的总影响使得存在着一个最佳流速值 即速率方程式中塔板高度对流速的一阶导数有一极小值 143 三 影响谱带变宽的其它因素 1 非线性分配色谱2 载体表面活性吸附中心造成的拖尾峰3 柱外效应 144 当溶质浓度较低时 K为常数 Cs与Cm成线性关系 其相应的色谱过程称为线性色谱 1 非线性分配色谱 145 CM CS CS CM 非线性色谱 其具有以下几个特点 a 溶质洗脱峰不再是对称的正态分布 而是有 拖尾 或 伸舌 现象 b 样品的保留值可变 线性色谱中同一样品的保留值是常数 只随样品不同而变化 c 色谱峰的峰高与浓度不是线性关系 在线性色谱中峰高与组分是线性关系 峰高是定量分析的重要数据 在非线性色谱中 峰高增加的速率随浓度的增加而逐渐降低 因而峰高不能作为定量分析的指标 146 3 气相色谱速率理论的要点 1 组分分子在柱内运行的多路径与涡流扩散 浓度梯度所造成的分子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色谱峰扩展柱效下降的主要原因 2 通过选择适当的固定相粒度 载气种类 液膜厚度及载气流速可提高柱效 3 速率理论为色谱分离和操作条件选择提供了理论指导 阐明了流速和柱温对柱效及分离的影响 4 各种因素相互制约 如载气流速增大 分子扩散项的影响减小 使柱效提高 但同时传质阻力项的影响增大 又使柱效下降 柱温升高 有利于传质 但又加剧了分子扩散的影响 选择最佳条件 才能使柱效达到最高 147 二 Giddings方程式 液相色谱速率理论液相色谱与气相色谱的的主要区别在于液体和气体性质的差异 148 1 涡流扩散项He He 2 dp 1958年 Giddings和Snyder等提出液相色谱速率方程式 149 2 纵向扩散项Hd 150 3 传质阻力项 1 固定相传质阻力项 2 流动相传质阻力项 i 流动的流动相中的传质阻力项Hm ii 滞留的流动相中的传质阻力项Hsm 151 152 153 154 155 在高效液相色谱中 液体的扩散系数仅为气体的万分之一 则速率方程中的分子扩散项B U较小 可以忽略不计 即 H A B u Cu故液相色谱H u曲线与气相色谱的形状不同 如图所示 提高柱内填料装填的均匀性和降低粒度选用低粘度的流动相或适当提高柱温 156 4 柱外展宽 超柱效应 柱前展宽 主要是由进样引起的柱后展宽 主要是由连接管 检测器流通池体积所引起的 157 色谱峰越窄 理论塔板数就越 理论塔板高度就越 柱效能就越 158 一 分离度 评价分离情况的综合指标 塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离程度 即柱效为多大时 相邻两组份能够被完全分离 难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合影响 保留值之差 色谱过程的热力学因素 区域宽度 色谱过程的动力学因素 色谱分离中的四种情况如图所示 第四节分离度与基本色谱分离方程式 159 讨论 色谱分离中的四种情况的讨论 柱效较高 K 分配系数 较大 完全分离 K不是很大 柱效较高 峰较窄 基本上完全分离 柱效较低 K较大 但分离的不好 K小 柱效低 分离效果更差 160 分离度的表达式 R 0 8 两峰的分离程度可达89 R 1 分离程度98 R 1 5 达99 7 相邻两峰完全分离的标准 161 令W2 W1 W 相邻两峰的峰底宽近似相等 引入相对保留值和塔板数 可导出下式 二 色谱分离基本方程式 色谱分离基本方程式 柱效项 柱容量项 柱选择项 162 1 分离度与柱效的关系 提高分离度的方法 增加柱长 或降低理论板高 注 对于一定理论板高的柱子 163 2分离度与容量比的关系 容量因子 1 k 10 改变k的方法 改变柱温和相比 164 3分离度与柱选择性的关系 选择因子 增大 的最有效方法是选择合适的固定液 165 太小 两组分未分开应改变固定相极性 降低柱温 k太小 n也太小 应增大固定液用量 降低柱温 n太小 许多组分未分开应设法降低板高 提高柱效 如何根据具体情况优化分离 166 已知任何两项 可求第三项 4 分离度 柱效和选择性参数关系 167 有效塔板表示的色谱基本方程 n与n有效关系 168 二化学键合相色谱法的流动相理想的溶剂应有下列特性 与固定相不发生化学反应 对试样有适宜的溶解度 使k在1 10范围内 与检测器相适应 例如用紫外检测器时 选用截止波长小于检测波长的溶剂 对于折光率检测器 要求选择与组分折光率有较大差别的溶剂作流动相 以达到最高灵敏度 169 4 高纯度 否则基线不稳或产生杂峰 同时可使截止波长增加 5 低的粘度 若使用高粘度溶剂 势必增高压力 不利于分离 常用的低粘度溶剂有丙酮 甲醇和乙腈等 但粘度过低的溶剂也不宜采用 例如戊烷和乙醚等 它们容易在色谱柱或检测器内形成气泡 影响分离 170 一 流动相对分离的影响n由色谱柱 固定相 性能决定 主要受溶剂种类的影响 k受溶剂配比的影响 171 二 流动相的强度和选择性溶剂的极性 强度 正相色谱 溶剂极性越强 洗脱能力越强反相色谱 极性弱的溶剂洗脱能力强溶剂的选择性不同种类的溶剂 分子间的作用力不同 故选择性不同混合溶剂 二元或多元流动相 172 一 高效液相色谱中的速率理论vanDeemter方程 H A B u Cu1 涡流扩散项A 2 dpA与填充物的平均直径dp的大小和填充不规则因子 有关 三 分离条件的选择 173 2 纵向扩散项B u纵向扩散项系数为B 2 Dm式中 弯曲因子 Dm 组分在流动相中的扩散系数Dm与流动相的粘度 成反比 与温度成正比 由于液体的粘度比气体大得多 约102倍 且在常温下操作 因此组分在液相中的扩散系数只有气体中的1 105 故在液相色谱中B可以忽略 174 3传质阻抗由三个系数组成 C Cs Cm CsmCs 固定相传质阻抗Cm 流动相传质阻抗Csm 静态流动相传质阻抗 175 GC中 固定液的传质阻抗起决定作用 C Cs 而HPLC中 固定液 是键合在载体表面固定液官能团的单分子层 厚度df可以忽略 因此 Cs可以忽略 1 固定相传质阻抗 176 2 流动相传质阻抗Cm由于在流路中心的流动相中的组分分子还来不及扩散进入流动相和固定相界面 就被流动相带走 因此总是比靠近填料颗粒与固定相达到分配平衡得分子移动得快些 从而使色谱峰变宽 Cm与固定相颗粒粒度dp得平方成正比 与组分分子在流动相中得扩散系数成反比 m是由柱和填充的性质决定的因子 177 3 静态流动相传质阻抗Csm由于固定相的多孔性 使部分流动相滞留在固定相微孔内 流动相要与固定相进行质量交换 必须先扩散到微孔内 如果固定相的微孔多 且又深又小 传质阻抗就大 使峰展宽就严重 Csm固定相颗粒粒度dp得平方成正比 与组分分子在流动相中得扩散系数成反比 sm与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数及容量因子有关 178 179 H A Cmu Csmu原因 化学键合相 液体流动相 结果 HPLC的实验条件应该是 小粒度 均匀的球形化学键合相 低粘度流动相 流速不宜过快 柱温适当 HPLC中的速率理论 180 1 固定相 极性键合相氰基键合相 分离含双键的化合物氨基键合相 分离多官能团化学物如甾体 强心苷 糖类等2 流动相 烷烃 极性调节剂如正己烷 异丙醚 二 正相键合相色谱法的分离条件 181 三 反相键合相色谱法的分离条件 1 固定相 非极性键合相短链烷基键合相 分离极性化合物苯基键合相 分离芳香化合物和多羟基化合物ODS 分离各种类型的化合物2 流动相 水 极性调节剂 抑制剂极性调节剂 甲醇 乙腈抑制剂 弱酸 HAc 弱碱 NH3 缓冲液 磷酸盐 醋酸盐 182 四 反相离子对色谱法的分离条件 1 固定相 非极性键合相选用表面覆盖度高的键合相 C8 C182 流动相 极性溶剂 离子对试剂离子对试剂 季铵盐 分析酸类或带负电的物质烷基磺酸盐 硫酸盐 分析碱类或带正电荷的物质流动相pH 使试样组分与离子对试剂全部离子化有机溶剂 被测组分或离子对试剂的疏水性越强 需有机溶剂的比例越高 183 第四节高效液相色谱分析方法一 定性分析方法HPLC的定性方法与GC相似 可分为色谱鉴定法及非色谱鉴定法两类 1 色谱鉴定法保留时间或相对保留时间对照 2 化学鉴定法分离后收集组分定性 184 3 两谱联用鉴定法 1 两谱联用法 用HPLC制备纯组分 用光谱仪器鉴定 2 两谱联用仪 能同时获得定性 定量信息 如HPLC UV HPLC FTIR及HPLC MS等 185 二 定量分析方法液相色谱法的定量方法与气相色谱法相同 常用外标法及内标对比法等进行定量分析 1 外标法以待测组分的纯品作对照物质 对比求算试样含量的方法称为外标法 可分为外标工作曲线法 外标一点法及外标二点法等 2 内标法分为工作曲线法 内标一点法 内标二点法 内标对比法及校正因子法等 在HPLC中最常用内标对比法 186 1 相对分子量 分子量 2000 凝胶色谱柱 分子量 2000 但同时分子量相差 10 凝胶色谱柱 分子量 2000的水溶性电解质 酸性物质用阴离子交换树脂 碱性物质用阳离子交换树脂 三高效液相色谱分离分析方法的选择 187 分子量 2000的水溶性非电解质 选用反相色谱法 分子量 2000的非水溶性物质 弱极性物质选用反相色谱法 极性物质选用正相色谱法 188 2 溶解度 189 3 化学结构 190 191 192 第4章仪器使用细节 193 1 HPLC用水 专门的纯水机或超纯水机 去离子水重蒸 二次或三次重蒸水 采用类似家用的纯水机 市场上瓶装的纯净水或蒸馏水 其它途径 194 2 样品 溶解样品用溶剂最好是流动性 或者用溶剂强度与流动相相近的溶剂 进样样品要求无微粒 样品溶液均要用0 45 m的滤膜过滤 195 3 流动相的配制 流动相通常按体积比配制 流动相在使用前一般都需要过滤 尤其使用了加缓冲盐的流动相时 如果没有自动脱气装置 流动相配好后应该采用合适的方法脱气 如超声波脱气 真空脱气 氦气脱气等 196 在HPLC系统中使用的注射器针头有别于气相色谱 是平头注射器 一方面 针头外侧紧贴进样器密封管内侧 密封性能好 不漏液 不引入空气 另一方面 也防止了针头刺坏密封组件及定子 尽快转动阀 不能停留在中途 否则过高的压力在柱头上引起损坏 六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种 使用部分装液法进样时 进样量最多为定量环体积的75 并且要求每次进样体积准确 相同 使用完全装液法进样时 进样量最少为定量环体积的3至5倍 即20 l的定量环最少进样60至100 l的样品 这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液 达到所要求的精密度及重现性 4 六通阀的使用 197 防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损 为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中 每次结束后应冲洗进样器 通常用不含盐的稀释剂 水或不含盐的流动相冲洗 在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗 198 5 泵的保养 使用流动相尽量要清洁 进液处的砂芯过滤头要经常清洗 流动相交换时要防止沉淀 避免泵内堵塞或有气泡 199 色谱柱问题及解决方法 保留值和分离度的重现性 影响方法的准确度与精密度谱峰拖尾 分离质量下降 精密度下降色谱柱寿命 6 色谱柱 200 201 样品溶剂对分离结果的影响 202 柱子在任何情况下不能碰撞 弯曲或强烈震动 当柱子