ch8 蛋白质分选与膜泡运输.doc

第八章 蛋白质分选与膜泡运输第一节 细胞内蛋白质的分选蛋白质分选细胞内存在不同的机制确保蛋白质转运至细胞的特定部位，这一过程称为蛋白质寻靶/定向转运（protein targeting）或蛋白质分选(protein sorting)。一、信号假说与蛋白质分选信号1信号假说 分泌性蛋白N端序列作为信号肽，指导分泌性蛋白到内质网膜上合成，然后在信号肽引导下蛋白质边合成边通过易位子蛋白复合体进入内质网腔，在蛋白质合成结束前信号肽被切除。2. 指导蛋白在糙面内质网合成的决定因素（1）信号肽（signal peptide）引导新合成肽链转移到内质网上的一段多肽，位于蛋白质的N端，又称开始转移序列。（2）信号识别颗粒（signal recognition particle,SRP） 一种核糖核蛋白复合体，一般存在于细胞质中，当新合成的信号肽从多聚核糖体上延伸暴露出来，SRP即可于新生信号肽序列和核糖体大亚基结合，又可与内质网停泊蛋白（docking protein, DP）即SRP受体结合。（3）停泊蛋白（docking protein, DP） SRP受体，存在于内质网膜上，可特异地与SRP结合。（4）停止转移序列 肽链上的一段特殊序列，与内质网膜的亲和力很高，能阻止肽链继续进入内质网腔，使其成为跨膜蛋白质。（5）移位子（translocon） 内质网膜上由34个Sec61蛋白复合体构成的类似炸面圈的结构，是蛋白质进入内质网的通道。3. 分泌性蛋白在内质网上合成的共翻译转运(cotranslational translocation)过程4. 导肽（leader peptide）/转运肽（transit peptide）/靶向序列 线粒体、叶绿体中绝大多数蛋白质以及过氧化物酶体中的蛋白质也是在某种信号序列的指导下进入这些细胞器中，为了研究方便，有人将这种信号序列称为导肽(线粒体)、转运肽（叶绿体）或靶向序列（过氧化物酶体）。二、蛋白质分选转运的基本途径与类型1. 核基因编码的蛋白质的分选途径大体可分为2条途径：后翻译转运途径、共翻译转运途径2. 蛋白质的分选运输类型（有4类）（1）跨膜转运（transmembrane transport）蛋白质通过跨膜通道进入目的地。如细胞质基质中合成的蛋白质在信号序列的引导下，以不同的机制转运到内质网、线粒体、叶绿体和过氧化物酶体。（2）膜泡运输（vesicular transport）蛋白质被选择性地包装成运输小泡，定向转运到靶细胞器。如内质网向高尔基体的物质运输、高尔基体向溶酶体、质膜和细胞表面的物质运输都属于这种运输方式。（3）选择性的门控转运（gated transport）如核孔可以选择性的主动运输大分子物质和RNP复合体，并且允许小分子物质自由进出细胞核。（4）细胞质基质中蛋白质的转运三、蛋白质向线粒体、叶绿体和过氧化物酶体的分选（一）蛋白质从细胞质基质输入到线粒体1. 蛋白质从细胞质基质输入到线粒体基质（1）线粒体基质蛋白靶向序列的特点N端，2050aa, 富含疏水aa、带正电荷的碱性aa(Arg、Lys)和羟基aa(Ser、Thr)，缺少带负电荷aa(Asp、Glu)，形成两性螺旋。（2）蛋白质从细胞质基质输入到线粒体基质的基本步骤步骤1：在游离核糖体合成的前体蛋白，与胞质蛋白分子伴侣Hsc70结合，使其保持未折叠或部分折叠状态，其N端具有基质蛋白靶向序列。步骤2、3：前体蛋白与内外膜接触点附近的输入受体Tom20/22结合，被转运进输入孔。步骤4、5： 输入的蛋白进而通过内外膜接触点的输入通道（外膜为Tom40,内膜为Tim23/17），线粒体基质分子伴侣Hsc70与输入蛋白结合并水解ATP以驱动基质蛋白的输入。步骤6：输入的基质蛋白的基质靶向序列，在基质蛋白酶作用下被切除，同时Hsc70从基质蛋白释放出来。步骤7：基质蛋白进而折叠成活性构象。第二节 细胞内膜泡运输一、膜泡运输概观膜泡运输是一种高度有组织的定向运输，各类运输泡之所能够被准确地运到靶细胞器，主要是因为细胞器的胞质面具有特殊的膜标志蛋白。大多数运输小泡是在膜的特定区域以出芽的方式产生的。其表面具有一个笼子状的由蛋白质构成的衣被（coat）。这种衣被在运输小泡与靶细胞器的膜融合之前解体。衣被具有两个主要作用：选择性的将特定蛋白聚集在一起，形成运输小泡；如同模具一样决定运输小泡的外部特征，相同性质的运输小泡之所以具有相同的形状和体积，与衣被蛋白的组成有关。已知有3类具有代表性的衣被蛋白包被膜泡，即：笼形蛋白/接头蛋白（clathrin/adaptor protein）包被膜泡、COPI(coat protein I)包被膜泡和COPII(coat protei II)包被膜泡，各自介导不同的运输途径。膜泡运输的蛋白质的分选信号膜泡运输的蛋白质，既可以是膜蛋白，也可以是与膜受体结合的可溶性蛋白。蛋白质包装的特异性取决于被转运的蛋白质的靶向分选序列，借以区分哪些蛋白质将被进一步包装转运，哪些将作为驻留蛋白而排出在转运膜泡之外。二、COP II包被膜泡的装配和运输COP II包被膜泡介导从内质网到高尔基体顺面膜囊的物质运输。1. COP II 包被的组分COP II衣被由多种蛋白质构成。（1）Sar 1衣被招集GTP酶（coat-recruitment GTPase）；起分子开关的作用，结合GDP的形式没有活性，位于细胞质中；结合GTP而活化，转位至膜上，能与衣被蛋白结合，促进核化和组装。（2）Sec 12ER膜蛋白，为Sar1的鸟苷酸交换因子，使Sar1释放GDP结合GTP而被激活。（3）Sec23/Sec24和Sec13/Sec31结合GTP的活化Sar1募集Sec23/Sec24复合体，形成紧紧包围着膜的一层衣被；随后，Sec13/Sec31复合体形成覆盖在外围的一层衣被。Sec23亚基也为Sar1的GTP酶激活蛋白，促进Sar1结合的GTP水解而结合GDP，引发包被去装配而解聚。Sec24为ER转运膜蛋白胞质结构域受体。COP II衣被所识别的分选信号位于跨膜蛋白胞质面的结构域，形式多样，有些包含双酸性基序，如Asp-X-Glu序列（X为任何一种氨基酸）。（4）Sec16是一种纤维蛋白，增加包被蛋白的聚合效率。2. COP II包被膜泡的装配过程细胞质基质中可溶性Sar 1-GDP与Sec12相互作用，催化GTP置换GDP形成Sar 1-GTP而激活；激活的Sar 1-GTP暴露出疏水N端并插入ER膜，然后开始召集衣被蛋白Sec23/Sec24，形成Sar 1-GTP/ Sec23/Sec24三重复合物，促使ER膜出芽。包被蛋白（Sec24）与被转运的膜蛋白胞质结构域结合，其中有些膜蛋白作为腔内可溶性蛋白的受体。随后，Sec13/Sec31复合物与三重复合物结合。最后，Sec16结合在ER膜胞质表面，与已装配的复合物相互作用并组织其他包被蛋白的结合，形成COP II包被膜泡。当包被膜泡形成后，Sec23亚基促进Sar1结合的GTP水解而结合GDP，引发包被去装配而解聚，形成脱包被膜泡。三、COP I包被膜泡的装配与运输负责高尔基体反面膜囊到顺面膜囊、从高尔基体顺面网状区到内质网的膜泡运输，回收膜脂、内质网驻留膜蛋白和可溶性蛋白（内质网逃逸蛋白，escaped proteins）返回内质网。内质网通过两种机制维持蛋白质的平衡 ：一是转运泡将应被保留的驻留蛋白排斥在外。例如有些驻留蛋白参与形成大的复合物，因而不能被包装在出芽形成的转运泡中，结果被保留下来；二是通过对逃逸蛋白的回收机制，使之返回它们正常驻留的部位。内质网的正常驻留蛋白，不管在腔中还是在膜上，它们在C端含有一段回收信号序列（retrieval signals），如果它们被意外地逃逸进入转运泡从内质网运至高尔基体cis面，则cis面的膜结合受体蛋白将识别并结合逃逸蛋白的回收信号，形成COPI衣被小泡将它们返回内质网。 内质网腔中的驻留蛋白，如蛋白二硫键异构酶和协助折叠的分子伴侣，均具有典型的回收信号Lys-Asp-Glu-Leu（KDEL）。COPII、COPI和高尔基体顺面网状区膜上均有识别KDEL信号的受体，信号与受体的亲和力受到pH高低的影响，低pH促进结合，高pH有利于释放。在高尔基体顺面网状区，KDEL信号与其受体结合，通过COPI包被膜泡介导内质网的逃逸可溶性驻留蛋白返回内质网并释放到内质网腔内。内质网的膜蛋白（如SRP受体）在C端有一个不同的回收信号，通常是Lys-Lys-X-X（KKXX，X：任意氨基酸），其受体是COPI 衣被的和亚基，同样可保证它们的回收。四、网格蛋白/接头蛋白包被膜泡的装配与运输网格蛋白/接头蛋白衣被小泡是最早发现的衣被小泡，介导高尔基体到胞内体、溶酶体，以及质膜到胞内体的膜泡运输。五、转运膜泡与靶膜的锚定和融合1. 膜泡运输的关键步骤2. 涉及转运膜泡与靶膜锚定与融合的关键成分各类运输小泡之所以能够准确地和靶膜融合，是因为运输小泡表面的标志蛋白能被靶膜上的相应蛋白识别。（1）Rab及Rab效应器Rab（ras-like in rat brain, targeting GTPase），属于单体GTP酶，起分子开关作用，结合GDP失活，位于细胞质中；结合GTP激活，暴露出其类异戊二烯亲脂基团，转位到细胞膜、内膜和运输小泡膜上。Rab结构类似于Ras，已知30余种。不同膜上具有不同的Rab。Rab的作用是活化后转位到转运泡膜上，与靶膜上Rab效应器相互作用，使运输小泡锚定在靶膜上，并促进SNARE复合体形成。（2）SNARE（soluble NSF attachment protein receptor） SNARE为可溶性的N-乙基马来酰亚胺敏感因子结合蛋白受体，作用是介导运输小泡与靶膜的融合；动物细胞中已发现20多种SNARE，分别分布于特定的膜上；位于运输小泡上的叫作v-SNARE，位于靶膜上的叫作t-SNARE。特定的v-SNARE和 t-SNARE配对，能相互缠绕形成SNARE复合体，将运输小泡的膜与靶膜拉在一起，实现其特异性融合。SNARE复合体为四螺旋束复合体。（3）N-乙基马来酰亚胺敏感因子（NSF）和可溶性NSF结合蛋白（SNAP）NSF（N-ethylmaleimide-sensitive factor/fusion protein）是一种类似分子伴娘的ATP酶，与SNAP（soluble NSF attachment protein）结合，利用ATP水解的能量，将SNARE复合体的螺旋缠绕分开而被再利用。3. 转运膜泡与靶膜锚定与融合的模式（图8-14，神经元突触小泡与突触前膜的融合）转运膜泡与靶膜的锚定主要在于Rab-GTP与其效应器的的相互作用；转运膜泡与靶膜的融合的主要机制是v-SNARE和 t-SNARE的配对，形成SNARE复合体。步骤1：在供体膜上的鸟苷酸交换因子（GEF）识别并结合细胞质中特异性Rab-GDP蛋白，诱发GTP置换GDP，鸟苷酸交换引发Rab蛋白构象改变并暴露其共价结合的脂质基团，从而帮助Rab-GTP蛋白转位锚定在供体膜上，并随膜泡转移，在靶膜上Rab-GTP与Rab效应器结合，这种结合有助于膜泡锚定和v-SNARE和t-SNARE的配对；步骤2：v-SNARE蛋白（图中VAMP）与同类t-SNARE（图中syntaxin和SNAP25）胞质结构域相互作用，形成稳定的卷曲的SNARE复合体（四螺旋束复合体），将膜泡与靶膜紧密束缚在一起；具有GTPase活性的Rab 蛋白水解与之结合的GTP,释放可溶性Rab-GDP进入细胞质。在细胞质中，Rab-GDP