PGM测序方法-protocol.docx

314芯片测序方法文库构建：PCR扩增基因组DNA 的目标区域1. 选择下方合适的表格是基于用户选择的是2x的引物池还是5x的引物池。对每一个DNA和引物池的混合，将以下组分加入PCR 管内。以下表格提供了包含和未包含Ion AmpliSeq Sample ID Panel的反应体系。对多个反应可准备配置混合溶液。2X 引物池 (Cat. nos. 4477685, 4477686, and custom panels)成分不包含ID panel（ul）包含ID panel（ul）5X Ion AmpliSeq HiFi Mix442X Ion AmpliSeq Primer Pool1010可选: 20X Ion AmpliSeq Sample ID Panel-1gDNA, 10 ngYYNuclease-free Water6-Y5-Y总体积20205X 引物池(Cat. nos. 4471262 and 4475346)成分不包含ID panel（ul）包含ID panel（ul）5X Ion AmpliSeq HiFi Mix445X Ion AmpliSeq Primer Pool44可选: 20X Ion AmpliSeq Sample ID Panel-1gDNA, 10 ngYYNuclease-free Water12-Y11-Y总体积20202. 充分震荡，简单离心。3. 将PCR管置于PCR仪内，运行一下程序以扩增基因组上目标区域。阶段步骤温度时间持续酶活化992分钟循环数（根据下表格设置）变性9915秒退火/延伸604/8/16*分钟持续-10持续+*4分钟是对1536对引物池；8分钟是对1537-6144对引物池；16分钟是对6145-24576对引物池。+PCR产物可置于10过夜储存。引物对数目循环数标准DNA石蜡包埋DNA12-24212425-48202349-96192297-1921821193-3841720385-7681619769-153615181537-307214173073-614413166145-12288121512289-245761114注意：Readytouse panels: 当加入Ion AmpliSeq Sample ID panel时不需要调整循环数。Custom primer pools：如果一个custom 设计的panel中包含两个引物池，并分别落在不同的循环数分类中，请选用更大的循环数来扩增这两个引物池。一般标准样品可以增加一个循环，从而保证其扩增效率，石蜡切片样品可增加2-3个循环。如果引物池有两管及以上，应当分别扩增（10l体系）。扩增完后混合取20l进行下轮实验。暂停点 PCR产物可以储存在10C过夜，需要更长时间储存，可以置于20C. 部分消化引物序列1. 轻度离心PCR管将反应后溶液收集到管底。往每个混合反应液中加入2微升 FuPaReagent，总体系达到22微升。2. 充分振荡混匀，轻度离心将液体收集到管底。（也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀）3. 将PCR管放入PCR仪，按以下程序运行。温度时间5010分钟5510分钟6020分钟10持续（最长至1小时）将接头连接至扩增产物并纯化配置并运行连接反应1. 如果有可见的沉淀物在Switch溶液中，通过室温下震荡或上下吹吸来溶解并重悬。2. 小心PCR管加入以下成分到每个反应孔内消化样本。在加入之前可先混合Switch溶液和接头。成分体积 (L)Switch Solution4稀释的barcode接头混合物2总体积283. 在每个PCR管内加入2微升DNA连接酶。4.充分振荡混匀，轻度离心将液体收集到管底。（也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀）5.将PCR管放入PCR仪，按以下程序运行。温度时间2230分钟7210分钟10持续（最长至1小时）暂停点 产物可以置于20C保存。纯化未扩增的文库使用Agencourt AMPure XP试剂1.5x样本体积重要事项! 将AMPureXPreagent置于室温并充分振荡将磁珠混匀，使用时缓慢吸取.接下来的步骤需要使用新鲜配置的70%乙醇。对每个样品，混合230微升无水乙醇和100微升无核酶水。1. 将加完接头的文库转移至1.5ml离心管内，加入45微升（1.5x样本体积）的Agencourt AMPure XP试剂。用枪吹打5次使DNA与磁珠悬浮液充分混匀。2. 将混合液置于室温5分钟。3. 将1.5ml离心管置于DynaMag96SideMagnet(Cat.no.12331D)磁力架上，静置2分钟或者等溶液变清澈。小心地吸走并弃掉上清，不要扰动磁珠。4. 向离心管中加入150 L 新鲜配制的70%乙醇，在磁力上来回移动1.5ml离心管来洗涤磁珠，然后小心地弃去上清，不要扰动磁珠。5. 重复第4步，进行第二次洗涤。6. 确保乙醇液滴已全部从孔中吸走。将1.5ml离心管放置于磁力架上，室温空气干燥5分钟，注意不要过度干燥。7. 将1.5ml离心管从磁力架上拿开，在每管中加入50 L Low TE充分浸润磁珠。充分振荡混匀，轻度离心将液体收集到管底。（也可以选择用枪吸取一半以上的液体上下吹打至少5次来混匀）8. 将1.5ml离心管置于磁力架上2分钟。上清液中含有文库。文库扩增：1.将1.5ml EP管从磁力架上取下，加50 l Platinum PCRSuperMixHighFidelity 和2l ofLibraryAmplificationPrimerMix。Platinum PCR SuperMix High Fidelity和Library Amplification Primer Mix需要事先混合好。充分漩涡震荡后简单离心，或者用枪上下吹吸5次。2.将1.5ml EP管放在磁力架上至少2分钟，将上清约50l转移到一个干净的200L PCR内。3.运行一下PCR程序纯化扩增后的文库第一轮纯化1. 加入25l （0.5X的样品体积）AgencourtAMPureXPReagent到每个样品管中，用移液枪吹吸5次。2. 室温下静置5分钟。3. 将样品管放在磁力架上至少5分钟，直至溶液变澄清。4. 小心的将上清移入另一个干净的PCR管中。第二轮纯化1. 在第一轮纯化取到的上清中加入60l AgencourtAMPureXPReagent，用枪头反复吹吸5次2. 室温下静置5分钟。3. 将样品管放在磁力架上至少3分钟，直至溶液变澄清，将上清吸除。4. 加入150l新鲜配置的70%的酒精，缓慢旋转两圈，将上清吸除。5. 重复步骤46. 确保酒精完全被移除，打开管盖，常温干燥5分钟。7. 将样品管从磁力架上取下，加入50lLow TE，充分漩涡震荡，简单离心，或将移液枪调至40l吹吸5次。8. 将样品管放入磁力架后，静置两分钟，将上清转移到新的1.5ml离心管。Qubit定量1. 制备QubitdsDNAHSreagent稀释液：1l QubitdsDNAHSreagent加199lQubitdsDNAHSBuffer。2. 在10 L的amplifiedIonAmpliSeqlibrary中加入190 L的dyereagent，混合充分后静置2分钟。3. 1L样品中加入199L dye reagent进行测样。定量完成后，不同引物的相同样品的管合为一管（相同浓度）每管定到300PM，混合后能达到100PM。Ion PGM 200bp自动模本制备在Ion OneTouch 2 instrument上制备模板ISP1.4.1 Ion OneTouch 2仪器准备1.4.1.1 打开Ion OneTouch 2背面的电源开关；按触摸屏上OPEN LID，等待离心机盖打开；1.4.1.2参照图1将Recovery Tubes（Ion PGMTM Template OT2 Supplies 200）放置于Ion OneTouch 2离心收集器的转子中,随后将Recovery Routers（Ion PGMTM Template OT2 Supplies 200） 放置于相应位置，手动盖上离心机盖；图11.4.1.3 参照图2顺序将Ion OneTouch 2 Amplification Plate（Ion PGMTM Template OT2 Supplies 200） 放置于加热模块中，将加热模块手柄压向自己身体方向，盖上Ion OneTouch Lid，导管固定于上端的卡口和正面右上角的支架上，将Amplification Plate的注射针垂直插入Ion OneTouch DL Injector Hub，直至接触到底部的Recovery Router，然后松开注射针图265 4c 4b 4a312 1.4.1.4 Ion OneTouch Oil和Ion PGM OT2 Recovery Solution添加1.4.1.4.1每次开始使用新的Ion PGM Template OT2 200 Kit，丢弃掉前一个试剂盒使用的Ion OneTouch Sipper和Ion OneTouch Tubes，戴上新的乳胶手套，装上新的Ion OneTouch Sipper；将Ion OneTouch Oil 瓶（Ion PGMTM Template OT2 Solutions 200）上下颠倒10次，倒入任意一个新的Ion OneTouch Tube 中，约1/2满，安装至标示有的下方相应位置拧紧；Ion PGM OT2 Recovery Solution（Ion PGMTM Template OT2 Solutions 200）倒入另一个新的Ion OneTouch Tube 中，约1/3满，安装至标示有的下方相应位置拧紧；1.4.1.4.2 同一个Ion PGM Template OT2 200 Kit的后续使用准备时，将Ion OneTouch Oil （Ion PGMTM Template OT2 Solutions 200）瓶上下颠倒10次，取下有Ion OneTouch Oil的Ion OneTouch Tube，剧烈混匀至产生微小的气泡（图3），加入Ion OneTouch Oil，约1/2满，安装至标示有的下方相应位置拧紧；将Ion PGM OT2 Recovery Solution（Ion PGMTM Template OT2 Solutions 200）倒入另一个的含有Ion PGM OT2 Recovery Solution的Ion OneTouch Tube 中，约1/3满，安装至标示有的下方相应位置拧紧； 图31.4.2 Ion OneTouch反应液相准备及上机 1.4.2.1 按照如下表格顺序室温配置体系，试剂来自Ion PGMTM Template OT2 Reagents 200顺序试剂管盖颜色体积（ul）处理方式及状态1Nuclease-Free Water252Ion PGM Template OT2 200 Reagent Mix紫色500提前室温放置，充分溶解至无沉淀，漩涡混合确保充分溶解,使用后剩余的保存于43Ion PGM Template OT2 200 PCR Reagent B蓝色300充分溶解至无沉淀，漩涡混合确保充分溶解,使用后剩余的保存于室温4Ion PGM Template OT2 200 Enzyme Mix褐色50短暂离心后，冰上放置5测序用文库25将定量好的文库稀释至15ng/ml,取2ul稀释到25ulTotal900 1.4.2.2 将上述体系涡旋震荡5s，稍离心； 1.4.2.3 将Ion PGM Template OT2 200 Ion Sphere Particles最大速漩涡混匀1min，上下吸打5次后，吸取100ul，加入6.4.2.1的液相体系中，上下吸打混匀，室温放置备用； 1.4.2.4将Ion PGM OneTouch Plus Reaction Filter（Ion PGMTM Template OT2 Reactions 200）置于15ml离心管上（图4），将6.4.2.3种配制好的液相体系漩涡混匀5s，短暂离心2s；用1000ul移液器将所有的液相缓慢从距离另外两个孔较远的样品孔（图4）注入reaction filter，注意移液头与样品孔紧密接触插紧；图41.4.2.5 用1000ul移液器从此孔缓慢加入1000ul Ion OneTouch Reaction Oil（Ion PGMTM Template OT2 Solutions 200），更换一个新的1000ul Universal Fit Filter Tip移液头（防止交叉污染），再缓慢加入500ul Ion OneTouch Reaction Oil； 1.4.2.6 如图5，将加样孔置于左侧，顺时针倒转reaction filter，避免管内导管接触反应液相；图5 1.4.2.7 如图6，将reaction filter插入Ion OneTouch相应位置，边缘凸起位置朝向自己；凸起部分图6 1.4.2.8在系统显示屏上选择RUN（图7）；图71.4.2.9 选择Ion PGMTM Template OT2 200 kit(图8) 图81.4.2.10 然后选择Expert,最后点击NEXT开始运行。1.4.3 运行结束及Ion OneTouch 清洗6.4.3.1模板制备程序运行结束，在显示屏上选择两次next键，进入离心程序，约10min；6.4.3.2将注射针拔出，放入一个空的50mL的管子（图9）；图91.4.3.3打开离心收集器盖，用清洁纸巾将盖子上的液体擦拭干净，拿掉Recovery Router，小心缓慢将Recovery Tubes取出放于板架上，模板ISP位于Recovery Tubes底部外侧（图10）图101.4.3.4 拿掉Reaction Filter，将Cleaning Adapter （Ion PGMTM Template OT2 Supplies 200）凸出部分面向自己插入相应位置（图11）图111.4.3.5选择next键退出离心程序，回到主界面，在屏幕上选择Clear，1.4.3.6根据提示选择next，直至程序运行，运行时间约10min1.4.3.7清洗结束后取下Amplification Plate和废液管一起扔进专门的垃圾桶，关闭电源Ion OneTouchTM ES的操作及阳性模板富集 1.5.1 沿远离沉淀一侧，自液面开始小心将两管Recovery Tubes中的上清液吸掉，各剩余约50uL； 1.5.2取一个新的1.5mL的Non-Stick Tube，将Recovery Tubes中剩余50uL液体吹打10次后吸入其中； 1.5.3在两管Recovery Tubes中各加入100uL Wash Solution （Ion OneTouch 200 Solutions Kit v2），吹打混匀后，吸入6.4.2的1.5mL Non-Stick Tube中； 1.5.4在6.5.3的1.5mL Non-Stick Tubes中再加入1000uL 200uL Wash Solution，最大转速漩涡振荡10s混匀，15500g离心3min； 1.5.5沿远离沉淀一侧，自液面开始小心吸掉上清液，剩余100uL在管底，低速漩涡振荡10s混匀； 1.5.6配制好新鲜的1M NaOH(1M NaOH最长可在一周内使用)；取一个1.5mL普通离心管，按如下表格配制Melt-Off Solution（每次新鲜配制）顺序试剂体积（ul）1Tween solution(Ion PGMTM Template OT2 Solutions 200)28021M NaOH40Total3201.5.7吸取130uL MyOne Beads Wash Solution到一个新的1.5mL的Non-Stick Tube中；将Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads最大转速漩涡震荡30s，取13.0uL到上述1.5mL的Non-Stick Tube，漩涡振荡混匀30s，短暂离心2s； 1.5.8 将6.5.7的离心管置于DynaMag-2 magnet上2min或至溶液澄清，小心吸掉上清，避免碰触沉淀；将离心管从DynaMag-2 magnet上取下，吸取130uL MyOne Beads Wash Solution 到离心管中，漩涡振荡悬浮Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads；圆头方头 1.5.9取一个8-well strip（Ion PGMTM Template OT2 Supplies 200），方头永远放在面朝自己的左面，从左到右依次编号为1到8（图12）； 图121.5.10 按如下表格在8-well strip中加入相应试剂(Ion PGMTM Template OT2 Solutions 200)孔编号对应孔试剂1(方头第一个)6.5.5中的100ul模板ISP（U）26.5.8中130ul Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads（B）3300uL Ion OneTouch Wash Solution (W)4300uL Ion OneTouch Wash Solution (W)5300uL Ion OneTouch Wash Solution (W)6空7吸取300uL6.5.6中新鲜配制的 Melt-Off solution (M)8空1.5.11将8-well strip放入Ion OneTouch ES前方白色模块中的凹槽中，方头在左，紧靠在凹槽右侧； 1.5.12取一个新的Tip（Ion PGMTM Template OT2 Supplies 200）放入Tip Loader中，从支架上取下Tip Arm插入Tip Loader中，用力向下按紧1s，松开，取下Tip Arm放回支架上（一定要放到位），新的Tip已装在Tip Arm下方（图13）；图13 1.5.13 在Tip Arm下方的洞中放一个开口的0.2ml的PCR管,里面加入Neutralization Solution 10ul(Ion PGMTM Template OT2 Solutions 200)； 1.5.14 打开Ion OneTouch ES电源，按Start/Stop键，运行过程中显示屏上一直显示“run”，Ion OneTouch ES自动开始阳性模板富集； 1.5.15 富集过程结束是，Ion OneTouch ES会有蜂鸣提示，并且显示屏显示“End”，整个过程约40min； 1.5.16结束后，将用过的Tip取下，和8-well strip一起扔进专门的垃圾桶，关闭电源 1.5.17取出0.2mL PCR管扣上盖子，15500g离心3min； 1.5.18沿远离沉淀一侧，从液面开始小心吸掉上清，剩余10uL在管底；1.5.19加入200uL Ion OneTouch Wash Solution，上下吹打混匀10次，15500g离心3min,沿远离沉淀一侧，从液面开始小心吸掉上清，剩余10uL在管底； 1.5.20加入100uL Ion OneTouch Wash Solution，上下吹打混匀10次，若不立即进行后续的测序，可置于4保存2-3天。Ion PGM 200bp读长上机测序操作PGM的清洗 1.2.1 氯片清洗（如果PGM超过48个小时未使用，请首先用氯片清洗）；1.2.1.1将W1氯片清洗瓶用每次50ml 18M去离子水漂洗3次，备用；W1清洗瓶用每次50ml 18M去离子水漂洗3次后，加满250ml 18M去离子水，备用；1.2.1.2将1L的容器用每次100ml 18M去离子水漂洗3次，装满1L 18M去离子水，放入一片PGM Cleaning Tablet（Ion PGM Sequencing Solutions 200 Kit v2），静置10min；1.2.1.3 10min后，加入1ml 1M NaOH, 混匀（该溶液请在2-3小时之内使用）；1.2.1.4 用0.22m 滤器过滤250ml 以上氯片溶液到W1氯片清洗瓶中；1.2.1.5打开PGM电源，氩气输出气压调至30psi；1.2.1.6 PGM启动完毕后，点击进入Clean菜单，确保芯片座上有一块旧芯片；1.2.1.7按屏幕提示，勾选Chlorite cleaning，点击NEXT；1.2.1.8通过后按提示将W1氯片清洗瓶拧上W1位（保证有吸管）；1.2.1.9将W2和W3清洗瓶拧上相应的位置保证有各自的空清洗瓶及吸管，清空废液瓶的废液； 1.2.1.10去掉前端四种dNTPs尖底管，不要取下吸管，在吸管下放置废液缸；1.2.1.11按next，进入清洗程序；1.2.1.12第一轮清洗结束后，用18M去离子水涮洗W1位的吸管，将含250ml 18M去离子水的W1清洗瓶拧上W1位，按next进入第二轮清洗程序；1.2.1.13第二轮清洗结束，整个PGM清洗结束，可进入初始化步骤；1.2.2 18M去离子水清洗（两次初始化之间小于24h）；1.2.2.1 W1清洗瓶用每次50ml 18M去离子水漂洗3次后，加满250ml 18M去离子水，备用；1.2.2.2 打开PGM电源，氩气输出气压调至30psi；1.2.2.3 PGM启动完毕后，点击进入Clean菜单，确保芯片座上有一块旧芯片；1.2.2.4 按屏幕提示，勾选18-MOhm water cleaning，点击NEXT；1.2.2.5 通过后按提示将W1清洗瓶拧上W1位（保证有吸管）；1.2.2.6 将W2和W3清洗瓶拧上相应的位置保证有各自的空清洗瓶及吸管，清空废液瓶的废液； 1.2.2.7 去掉前端四种dNTPs尖底管，不要取下吸管，在吸管下放置废液缸；1.2.2.8 按next，进入清洗程序，18M去离子水清洗只进行一轮，结束后可以开始6.3 PGM初始化。PGM初始化1.3.1将试剂盒中dNTPs（Ion PGM Sequencing Reagents 200 Kit v2）取出，在冰上融化备用；1.3.2将W2试剂瓶（Ion PGM Sequencing Supplies 200 Kit v2）用每次200ml 18M去离子水漂洗3次，在上部接线处用记号笔标记（见图1，如果有两条接缝线，标记下面的那条），加入18M去离子水至标记处； 图11.3.3 将整瓶Ion PGM Sequencing 200 v2 W2 Solution倒如6.3.2的加了18M去离子水的W2试剂瓶中；1.3.4 加100mM NaOH 140ul到W2试剂瓶中，盖上瓶盖，上下倒置数次混匀后备用；1.3.5 W1,W3（Ion PGM Sequencing Supplies 200 Kit v2）试剂瓶用18M去离子水漂洗，每次50ml，漂洗3次；1.3.6 在W1试剂瓶中加入350ul 100mM NaOH溶液，盖上瓶盖备用；1.3.7 在W3试剂瓶中1X W3 Solution至50ml刻度处，盖上瓶盖备用；1.3.8 在主菜单界面中选择Initialize，保持芯片座上有一块旧芯片，按Next检测是否有漏气；1.3.9 按Next，根据屏幕提示，穿戴新的乳胶手套，将新的长吸管（Ion PGM Sequencing Supplies 200 Kitv2）换到W2位置的盖上（避免碰触其它表面），拧上制备好的W2试剂瓶（见图2）； 图21.3.10按Next，同样将制备好的W1和W3试剂瓶拧上各自的位置（用新的短吸管），确认密封无误；1.3.11按Next, 开始第一阶段的初始化过程，大约需要30min；1.3.12将冰上融化的四种dNTPs漩涡振荡混匀，短暂离心后放置于冰上；1.3.13在四个50ml的尖底离心管（试剂盒提供）标记上 dGTP, dCTP, dATP和dTTP;1.3.14用带滤芯的移液头在每管中加入相应的dNTP 20ul，冰上放置备用；1.3.15 第一阶段的初始化成功后，拔去前面dNTP溶液管位置上的旧的吸管，移走废液缸；1.3.16穿戴新的乳胶手套，在4个dNTP溶液管位置插上新的吸管（尾部为深蓝色），见图3； 图31.3.17 对应符号，拧上相应的dNTP溶液管（为dGTP，为dCTP，为dATP，+为dTTP）,确保密封;1.3.18按Next, 进行最后的初始化,1.3.19在所有初始化程序成功后,按Next结束初始化，可进入最后的测序反应。测序上样准备及测序1.4.1测序程序设定1.4.1 浏览器地址栏输入2mnnq1，进入Torrent Brower;1.4.2点击进入Planning页；1.4.3 根据测序类型点击相应类型的PLAN NEW RUN选项, 进入设定页面,第一部分是Application,可以在此修改需要的测序类型（图4）； 图41.4.4 点击NEXT，进入KIT设定，选择正确的library kit, Templating kit, sequencing kit(200bp DNA文库为例，选择IonPlus Fragment kit, Ion PGM Templating OT2 200kit,Ion PGM sequencing 200 kit v2)； Flows ：200读长选择500 、400读长选择850；如果使用Barcode,在Barcode Set里选择相应的Barcode数据库；最后选择相应的Chip Type（图5）; 图51.4.5 直接点击Reference,如果有参考序列选择相应的参考序列（图6） 图61.4.6 直接点击Plan,输入RUN Name和Sample Name,最后点击Plan完成程序设定（图7）。 图7314芯片的上样准备及测序1.5.1转移一半的模板ISP至200ul PCR管中；1.5.2 如果转移过来的样本ISP模板体积大于50ul，则 15,500 x g离心后，移去多余的上清，剩余50ul；小于等于50ul则直接到下一步；1.5.3漩涡振荡Control Ion Sphere 1min, 短暂离心2s，然后加5ul到样本模板ISP的PCR管中；1.5.4再加Annealing Buffer 150ul，漩涡振荡混匀，15,500 x g离心2min；1.5.5避开离心外侧，自上而下小心移去上清，剩3ul的溶液于管底；1.5.6加入3ul的Sequencing Primer到含3ul 模板ISP的PCR管中，用移液器吸打充分混匀；1.5.7热循环仪上，95 2min，37 2min处理，室温放置备用；1.5.8在PGM主菜单按RUN，确保旧的芯片在芯片座上，按Next选择测序试剂盒类型，继续按NEXT检测通路是否密封；1.5.9 检测通过后，脱掉乳胶手套将手指在接地金属板上碰触一下，取下旧芯片，将新的314芯片(400bp读长请一定使用314V2 chip)从包装袋中取出，放置于芯片座上（避免乳胶手套产生静电效应击穿芯片底座）；1.5.10 合上芯片上模块，操作屏上按Next，按提示扫描芯片包装袋的条形码，确认后按CHIPCHECK进行芯片检测；1.5.11检测通过后，将待测芯片置于Ion centrifuge adapter上（不要将芯片置于其它表面），重新替代入旧芯片，合上芯片上模块；1.5.12在引物杂交反应结束后的含样本ISP模板的PCR管中加入1ul的Sequencing Polymerase，混匀室温静置5min；1.5.13 45度手持芯片，用Rainin SR-L100F移液器和SR-L200F移液头垂直于芯片上样孔，尽量吸掉芯片中的液体（图8）； 图81.5.14将