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动物实验基本知识和操作技术 上海中医药大学实验动物中心汤家铭 1 进行动物实验操作前必须注意的事 一 动物福利和动物实验伦理问题什么是动物福利 动物福利是指动物在整个生命过程中应得到人类的保护 其基本原则是要善待动物 保证动物的健康和快乐 动物福利的提出是基于这样一个观点 即动物与人一样 有思维 有情感 应当给予与人一样的生存权 台湾学者夏良宙 1990年 把动物福利概括成两句话 善待活着的动物 减少动物死亡的痛苦 应该再加一句 动物死后应得到妥善处理 2 在国际上被普遍认可的动物福利包括以下5个内容 即 应提供给动物满足生长发育和繁衍后代的营养食物和清洁的饮水 使其免受饥渴 吃好喝好 应提供给动物适当的栖息之地和饲养场所 使其能休息和睡眠 休息好 应提供预防动物疾病和患病后及时诊疗的措施 使其免受疾病和伤害的痛苦 健康成长 应提供给动物安静的饲养环境 无刺激动物发生应激和恐惧的场面和声音 平静生活 应提供给动物同类一起自由玩耍 表达天性的空间和自由 表达天性 3 饲养繁殖实验动物的目的是用实验动物作为人类的替难者进行各种生物医学研究 一方面随着生物医学的发展 实验动物的使用量逐年增加 使用种类也逐年扩大 另一方面从动物福利和动物实验伦理学考虑 又需要尽量减少一些不必要的动物实验 特别是人类的宠物诸如猫 犬 猴等 或者在不得不做的动物实验中尽可能将动物的痛苦 压迫和不适降到最低 4 动物实验的伦理判断标准 1 必须权衡实验的目和得出的结论与动物由此而受到的伤害和死亡 2 必須清楚而且明确 沒有任何替代方法可达到所做的动物实验的目的 这个前提 3 必须将动物的痛苦 压迫和不适减到最低程度 5 二 动物实验是实践性非常强的技术和方法 不能仅靠书本理论知识 需要通过反复实践加以掌握 目的 保证实验的顺利进行 减少动物承受的痛苦 6 成为熟练掌握动物实验操作技术的能手或专家应该是大学 研究所每一个动物饲养管理人员所追求的目标 7 动物实验前的准备 1 所用动物实验设施是否符合本实验要求普通设施 清洁级 SPF设施 感染性设施 有毒有害供试品设施 放射性设施实验室 手术室2 所用实验动物的品种 品系 性别 数量等能否得到所需要的动物实验技术是否熟练掌握所用动物实验器具 试剂是否准备好所用的仪器设备是否处于可运行状态 8 6 预实验正式实验前的演习预实验可用少量动物进行预实验结果不能并入正式实验结果一起分析 9 一 动物的抓取 动物的抓取是顺利进行各项动物实验操作最基本的一个环节 应熟练掌握各种实验动物的抓取方法 用轻柔的手法把对动物施加的恐惧和痛苦降到最低 一般说来动物是不会主动攻击人的 小鼠抓取的注意点大鼠抓取的注意点3 豚鼠抓取的注意点 10 4 兔抓取的注意点最好戴人造革围裙和袖套 以免爪子抓伤 采用正确地抓取方法 可采用兔固定器固定进行实验操作 或一人抓取固定 一人实验操作 11 豚鼠和兔的抓取 12 5 犬抓取注意点实验用犬有专用的比格犬和农村收购来的草犬 犬是通人性的 草犬购入后 饲养人员和实验人员要经常亲近它们 使它放松对你的警惕 容易直接抓取它们 不要轻易使用长柄铁钳 钳伤造成的伤害会使它对你更加恐惧 影响以后实验的进行 抓取后用绳子将嘴绑住 13 二 动物实验分组设计 一 一般动物试验分组设计的基本原则 随机 对照和重复 随机 就是按照机遇均等的原则来进行分组 其目的是尽量减少各种干扰因素造成的实验误差 不受实验者主观因素或其他偏性误差的影响 随机化的手段可采用编号卡片抽签法 随机数字表或采用计算器的随机数字键 14 对照 是要求在实验中设立可与实验组比较 用以消除各种无关因素影响的对照组 对照应有可比性 同时同地同条件对照设立有两种方式 自体对照1 实验前后对照2 身体左右对照组间对照 以手术造成兔腹主动脉损伤动脉粥样硬化模型为例 1 正常 空白 对照组 正常饮食 不做手术2 假手术组 正常饮食 做手术3 模型组 手术 高脂饲料4 已知疗效药物组 手术 高脂饲料 已知疗效药物5 未知疗效药物组 手术 高脂饲料 未知疗效药物6 赋型剂对照 手术 高脂饲料 赋型剂 15 重复 是指同一处理要设置多个样本数 重复的主要作用是估计试验误差 降低试验误差和增强代表性 提高实验结果的精确度 保证实验结果能在不同个体中稳定地重复出来 样本数过少 实验处理效应不能充分显示 样本数过多 又会增加实际工作中的困难 因此在进行实验前必须确定最少的样本例数 最少的样本例数可按一般估测方法确定 也可通过统计学方法进行测算确定 16 二 动物实验分组设计的基本类型1 完全随机化设计2 按体重分层随机区组设计3 配对设计 17 二 按体重分层随机区组设计先确定实验的组数 将动物称重 按体重的轻重顺序编号 再用随机化工具 如随机数字表等 将动物随机分配至处理组及对照组 随机区组法举例以用四氧嘧啶诱发小鼠糖尿病模型 用药物进行治疗观察疗效为例 实验中可分为5组 正常对照组 模型组 药物治疗低剂量组 高剂量组和已知可治疗糖尿病药物组 每组10只 5雌5雄 按下列步骤进行分组 1 雌雄分开 分组时雌 雄动物分开分别进行 2 用记号笔在小鼠尾巴上随机编1 25号 3 按编号称重 记录每只小鼠的体重 4 按动物体重顺序依次重新编号 5 共5个实验组分成5个区组 每个区组都有5只体重相近的动物 第一区组5只动物为1 2 3 4 5号 第二区组为6 7 8 9 10号 余类推 6 抄录随机数表 抄录数字的个数等于区组数减1 如5个区组就抄录4个数字 第5个动物无随机数字 其分组为调剂 以后的区组按顺序依次抄录数字 7 将小鼠分到各组中 18 按体重分层随机区组分组 19 三 动物编号常用的标记方法 适用需要个体识别的实验染料标记法 适合白色被毛的动物 如小鼠 大鼠 豚鼠 兔等 黄色 常用3 5 苦味酸溶液红色 常用0 5 中性红溶液咖啡色 2 硝酸银溶液黑色 煤焦油酒精溶液优点 简单 易识别缺点 长期易退色 不能编大号码 20 21 2 剪耳 打孔 法 啮齿类小动物3 号码钳法 适用于兔 犬等大动物4 耳牌法 适用于羊 牛等大家畜5 电子芯片植入法 22 四 动物被毛的去除方法 1 剪毛法 用弯头剪逆毛方向剪适用于各种实验动物2 拔毛法 常用于兔的耳缘静脉注射3 剃毛法 剃须刀 手术刀适用于大动物4 脱毛法 脱毛剂 23 常用脱毛剂配方配方1 硫化钠8g溶于100mL水中 配方2 硫化钠 肥皂粉 淀粉的比例为3 1 7 再加水调成糊状 配方3 硫化钠10g和生石灰15g溶于100mL水中 配方1和2适用于家兔和啮齿类动物的脱毛 配方3适合给犬脱毛 脱毛后用清水将脱毛区清洗干净 24 五 实验动物的麻醉方法 对实验动物进行麻醉的目的是 消除实验过程中引起的痛苦和不适 确保实验动物的安全和动物实验的顺利进行 是动物实验伦理的一个重要方面 麻醉方法有全身麻醉和局部麻醉两种 在实验动物的麻醉中绝大多数采用全身麻醉 应结合实验目的 实验动物种类 日龄及健康状况等因素进行综合考虑 决定选用的麻醉剂和麻醉方法 25 全身麻醉简称全麻 全麻是指麻醉药通过呼吸道吸入 静脉和肌肉注射等途径 进入实验动物体内 使其产生短时间意识丧失 痛觉消失 肌肉松弛和反射抑制等中枢神经系统抑制现象 当麻醉药从体内排出或在体内代谢破坏后 实验动物逐渐清醒 不留后遗症 全麻有吸入麻醉法和注射麻醉法两种途径 吸入麻醉法用挥发性麻醉药 注射麻醉法用非挥发性麻醉药 26 1 吸入麻醉法常用药物为乙醚 氟烷和异氟烷等 吸入麻醉法有开放吸入和气管内插管吸入两种方法 开放吸入 适用于啮齿类小动物 可用乙醚 氯仿小动物吸入麻醉机国外已有售 气管内插管 适用于犬 猴 羊等大动物 氟烷和异氟烷是最常用的麻醉药 吸入麻醉的优点 麻醉平稳 安全可靠 停止吸入后很快苏醒缺点 需要一定的仪器设备 注意自身防护 27 大小鼠麻醉法 28 2 注射麻醉法注射麻醉法是使用非挥发性麻醉药进行全麻的方法 在动物实验中比较常用 常用麻醉药 戊巴比妥钠硫喷妥钠氯氨酮乌拉坦大动物 静脉注射或肌肉注射啮齿类动物 腹腔注射 29 实验动物麻醉应注意的事项大动物麻醉之前应禁食 麻醉之前应准确称量动物体重 作为计算麻醉剂用量的依据 应注意不同麻醉药对动物的作用是不同的 如戊巴比妥钠 硫贲妥钠等能抑制心肌收缩力 使肌肉松弛 而氯胺酮则相反 大动物犬 猴 羊等麻醉前半小时应注射麻醉前给药如阿托品和苯巴比妥钠 静脉注射麻醉药是必须缓慢 边注射边观察动物的意识 角膜反射 肌肉紧张性和对疼痛的反应 达到麻醉要求时应停止注射 30 6 大动物手术时应配备麻醉师 在麻醉过程中密切观察动物的反应 如血压 脉搏 呼吸和体温 及时调节麻醉药剂量 保证手术顺利进行 7 动物在麻醉期间 手术后至苏醒期体温会下降 应注意手术室的室温 8 注意术后护理 31 麻醉意外的抢救原因 麻醉药速度过快 剂量过大 麻醉过深后果 中枢神经系统抑制导致呼吸系统 循环系统功能障碍 引起呼吸 心跳停止 抢救方法 要针对具体情况 采取对症治疗的措施 1 立即停止供给麻醉剂2 人工呼吸 吸氧3 苏醒剂4 呼吸中枢兴奋剂如可拉明等和心脏和呼吸兴奋剂 如0 1 肾上腺素适量作心内或静脉注射 静脉滴注50 葡萄糖溶液等 32 六 实验动物的给药方法 经口给药法注射法其它途径给药方法呼吸道给药皮肤给药脊髓腔内给药脑内给药直肠内给药关节腔内给药 33 经口给药拌入饲料 饮水中自由摄取优点 省人力缺点 因个体差异 摄入量不等灌胃优点 能准确定量缺点 给动物造成一定的痛苦 需熟练掌握技术 34 大小鼠灌胃注意点用灌胃针 从嘴角处插入 到达咽部后改变灌胃针的方向 使其与食管的走向一致 然后顺利插入 成年大鼠由于体型较大 不易保定 办法 1 一人保定 一人灌胃2 操作者抓取后 将大鼠尾部按在自己的胸部 达到固定尾部的目的 然后灌胃 灌胃量 小鼠0 2 0 4ml 10克 大鼠1 0ml 100克 大小鼠灌胃 35 兔灌胃法采用用固定器一人操作 或一人保定一人操作法 操作者用左手拇指和中指挤压家兔两颊 将下颌挤开使兔被动张口 右手将开口器从一侧口角插入口腔并固定 用泡在水中的14号细导尿管 经开口器的孔插入 向前推进约15cm 可达胃内 确认泡在水中的导管另一端没有冒气泡 说明没有误入气管 即可注入药液 灌胃量为每只每次80 150mL 兔灌胃法 36 1 口服给药用右手将口服药片夹在拇指和食指之间 把左手放在犬的圈套上 用拇指和食指压着犬的上唇 用力使犬的头向后仰 继而把右手中指放在犬的下颌向下压 当犬的嘴张大时 快速把药片放在舌根隆起的部位 合上犬的嘴 维持头后仰姿势 右手在咽喉部轻轻按摩 借助犬本能的吞咽动作服下药片 犬的胶囊给药法 37 2 灌胃给药在给犬灌胃时 将犬固定于特制的固定架上 实验时将木制开口器从一侧口角放入犬的口腔 用左手或绳子固定 右手持12号胃管由开口器的小圆孔向咽后壁方向不断插入 导管另一端置于一杯清水中 若连续出现气泡 说明插入呼吸道 应立即拔出胃管 重新操作 如无气泡 说明没有插入气管 插至约20cm 即可到达胃内 犬的灌药量为每只每次200 500mL 犬的灌胃给药法 38 各种动物一次灌胃能耐受的最大容积 39 注射法注射法有皮下注射 腹腔注射 静脉注射 肌肉注射以及皮内注射 脑内注射等 药物吸收速度 静脉注射 腹腔注射 肌肉注射 皮下注射 皮内注射常用于观察皮肤血管通透性变化或反应 如过敏试验脑内注射常用于病毒学接种 40 静脉注射大小鼠尾静脉和足背正中静脉注射 大小鼠尾静脉注射 41 豚鼠阴茎静脉注射 豚鼠足背正中静脉注射 42 兔耳缘静脉注射 犬前肢头静脉和后肢小隐静脉注射 43 其它途径给药方法呼吸道给药 皮肤给药 脊髓腔内给药 4 脑内给药 5 直肠内给药 6 关节腔内给药 44 动物间以及动物与人之间给药等效剂量的换算 在药理学毒理学上常涉及到给动物多少剂量的问题 不同种属动物间的剂量换算动物与人之间的剂量换算人与动物间的计量换算等效剂量 不同动物间或动物与人之间可能产生相同药效的剂量 等效剂量与单位体重的动物体表面积成正比 45 表1 标准体重动物由动物a到动物b的mg kg换算系数 剂量 换算系数 动物剂量换算成人剂量 例1 已知150g大鼠用5mg kg 换算成成人的用药剂量 查表大鼠a行 成人b列的换算系数为0 162 故成人的剂量 5 0 162 0 81mg kg 一种动物剂量换算成另一种动物剂量 例2 已知20g小鼠用4mg kg 换算成8kg比格犬的用药剂量 查表小鼠a行 比格犬b列的换算系数为0 15 故比格犬的剂量 4 0 15 0 60mg kg 46 非标准动物的换算非标准动物换算成标准动物 给药剂量 校正系数Sa 换算系数标准动物换算成非标准动物 给药剂量 换算系数 校正系数Sb非标准动物换算成非标准动物 给药剂量 校正系数Sa 换算系数 校正系数Sb例3 长期毒性试验350g大鼠用10mg kg 换算成8kg比格犬的用药剂量 查表2 350 150 2 3 校正系数Sa 1 301 再查表1大鼠a行 比格犬b列的换算系数为0 30 故8kg比格犬的剂量 10 1 301 0 30 3 90mg kg 表2 非标准体重动物的校正系数 47 一 采血法大小鼠剪尾尾静脉切割大鼠后肢足中静脉采血眼眶后静脉丛采血摘眼球采血腋窝动静脉采血心脏采血腹主动脉采血 七 实验动物体液的采集方法 48 心脏采血 眼眶后静脉丛采血 足背正中静脉采血 腹主动脉采血 49 小鼠颌下静脉采血法 50 大小鼠不同采血方法的比较 51 豚鼠心脏采血 兔耳缘静脉采血 兔心脏采血 兔颈总动脉采血 52 一个动物到底能采多少血 取决于动物的体重 定期活体采血还是处死采血 动物的全血量为动物体重的8 左右 其中约30 储藏在全身毛细血管内 全血中约50 是有形成分 据此可测算处死后的采血量和血清量 采血为全血量的10 时 两个星期恢复 采血为全血量的30 时 将危及生命 53 血清和血浆的区别不同的实验对血液样品的要求不同 有的要求全血 有的要求血清或血浆 血清是指血液凝固后析出的淡黄色的液体 血浆是指血液经过抗凝后去除有形成份后的淡黄色液体 血清和血浆的区别在于血清中不含纤维蛋白 而血浆中含有与凝血有关的许多酶原和纤维蛋白原 常用的抗凝剂有肝素 枸橼酸钠 乙二胺四乙酸 EDTA 钠盐或钾盐 54 各种实验动物活体安全采血量和致死采血量 55 二 采尿法反射排尿法代谢笼法导尿法膀胱穿刺法 兔采粪尿 比格犬采粪尿 大鼠采粪尿 56 八 实验动物常用处死方法 安死术的概念 安死术 是指以人道的方法处死动物的过程 在处死动物过程中减少动物的惊恐或焦虑 安静地 无痛苦地死亡 57 采用安死术必须符合的标准死亡时没有惊恐 疼痛的表现使其在最短时间内失去意识 迅速死亡方法可靠且可重复对操作人员安全采用的方法要与研究要求和目的一致对观察者和操作者的情绪影响最小对环境污染的影响最小设备简单 价廉 易操作处死动物地点应远离 并与动物室隔开 58 大鼠小鼠1 颈椎脱臼法2 急性失血法3 麻醉致死法4 气体窒息致死法 59 猫 犬 兔1 空气栓塞法优点 方法简单 迅速 缺点 由于动物死于急性循环衰竭 各脏器凝血十分明显 2 急性失血法先行麻醉 再分离颈动脉或股动脉 将一根较粗的塑料管插入动脉内放血 动物在3 5min内即可死亡 优点 动物十分安静 对脏器无损伤 对活杀采集病理切片标本是一种比较好的方法 3 化学药物致死法通过注射一定量的化学药物而使动物迅速致死 常用的化学药物有 10 氯化钾溶液 静脉注射 用量为犬20 30ml 只 兔5 10ml 只 10 福尔马林 静脉注射 用量为犬20ml 只 60 大小鼠安乐死法 豚鼠二氧化碳窒息法 61 九 动物实验后的护理 1 麻醉苏醒前注意保温保持呼吸道通畅定时观察记录动物的生命体征2 创口处理彻底清创处理 必要时放置引流条可以不用敷料覆盖创口3 抗菌素治疗4 饮食和输液大手术后适当输液能加快恢复犬 猴手术后给与高蛋白 高能量饮食 62 十 动物活体解剖 脏器称重及病理取材方法 动物实验后进行活体解剖是动物实验最后一个重要步骤 通过活体解剖和病理学观察 可以分析药物的作用 各器官病变特点 观察实验效果 为分析实验结果提供大体病理和组织病理学依据 63 活体解剖程序 64 腹腔检查胃 十二指肠 空肠 回肠 盲肠 结肠 直肠肝 脾 胰腺 肾 肾上腺 肠系膜淋巴结睾丸 副睾 输精管 前列腺 精囊腺卵巢 输卵管 子宫 65 胸腔检查心脏 肺 气管 支气管 胸腺颅脑检查大脑 小脑 脑干 脊髓 66 脏器秤重由于动物的各组织器官在肿瘤 增生 炎症 萎缩等病变时会产生重量上的改变