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第四章二维核磁共振谱4 1二维核磁共振的概述 1 什么是二维谱二维核磁共振 2DNMR 方法是有Jeener于1971年首先提出的 是一维谱衍生出来的新实验方法 引入二维后 减少了谱线的拥挤和重叠 提高了核之间相互关系的新信息 因而增加了结构信息 有利于复杂谱图的解析 特别是应用于复杂的天然产物和生物大分子的结构鉴定 2DNMR是目前适用于研究溶液中生物大分子构象的唯一技术 一维谱的信号是一个频率的函数 记为S 共振峰分别在一条频率轴上 而二维谱是两个独立频率变量的信号函数 记为S 1 2 共振峰分布在由两个频率轴组成的平面上 2D NMR的b最大特点是将化学位移 偶合常数等参数字二维平面上展开 于是在一般一维谱中重叠在一个频率轴上的信号 被分散到两个独立的频率轴构成的二维平面上 同时检测出共振核之间的相互作用 2 二维谱实验 A 原则上二维谱可以用概念上不同的三种实验获得 如图4 1 1 频率域实验 frequency frequency 2 混合时域 frequency time 实验 3 时域 time time 实验 它是获得二维谱的主要方法 以两个独立的时间变量进行一系列实验 得到S t1 t2 经过两次傅立叶变换得到二维谱S 1 2 通常所指的2D NMR均是时间域二维实验 图4 12D NMR三种获得方式 B 二维核磁共振时间分割 二维谱实验中 为确定所需的两个独立的时间变量 要用特种技术 时间分割 即把整个时间按其物理意义分割成四个区间 如图所示 1 预备期 预备期在时间轴上通常是一个较长的时期 使核自旋体系回复对平衡状态 在预备期末加一个或多个射频脉冲 以产生所需要的单量子或多量子相干 2 发展期 在t1开始时由一个脉冲或几个脉冲使体系激发 此时间系控制磁化强度运动 并根据各种不同的化学环境的不同进动频率对它们的横向磁化矢量作出标识 3 混合期 在此期间通过相干或极化的传递 建立检测条件 4 检测期 在此期间检测作为t2函数的各种横向矢量的FID的变化以及它的初始相及幅度受到t1函数的调制 与t2轴对应的 2 轴 通常是频率轴 与t1轴对应的 1是什么 取决于在发展是何种过程 相干 ccherence 是描述自旋体系状态的波函数之间关系的一种物理量 它通常没有简单的模型 它是横向磁化及相位的量 不仅包括 m 1 而且包括 m 0 m 2状态之间关系 它可以通过射频脉冲的作用传递 C 实验过程 用固定时间增量 t1依次递增t1进行系列实验 反复叠加 因t2时间检测的信号S t2 的振幅或相位受到s t1 的调制 则接收的信号不仅与t2有关 还与t1有关 每改变一个t1 记录S t2 因此得到分别以时间变量t1 t2为行列排列数据矩阵 即在检测期获得一组FID信号 组成二维时间信号S t1 t2 因t1 t2是两个独立时间变量 可以分别对它们进行傅立叶变换 一次对t2 一次对t1 两次傅立叶变换的结果 可以得到两个频率变量函数S 1 2 如图 3 二维谱的表达方式 1 堆积图 stackedplot 堆积图的优点是直观 具有立体感 缺点是难以确定吸收峰的频率 大峰后面可能隐藏小峰 而且耗时较长 2 等高线 Contourplot 等高线图类似于等高线地图 这种图的优点是容易获得频率定量数据 作图快 缺点是低强度的峰可能漏画 目前化学位移相关谱广泛采用等高线 图4 3堆积图等高线 4 二维谱峰的命名 1 交叉峰 crosspeak 出现在 1 2处 即非对角线上 从峰的位置关系可以判断哪些峰之间有偶合关系 从而得到哪些核之间有偶合关系 交叉峰是二维谱中最有用的部分 2 对角峰 Autopeak 位于对角线 1 2 上的峰 称为对角峰 对角峰在F1和F2轴的投影 5 二维谱的分类 二维谱可分为三类 1 J分辨谱 Jresolvedspectroscopy J分辨谱亦称J谱或者 J谱 它把化学位移和自旋偶合的作用分辨开来 包括异核和同核J谱 2 化学位移相关谱 chemicalshiftcorrelationspectroscopy 化学位移相关谱也称 谱 是二维谱的核心 通常所指的二维谱就是化学位移相关谱 包括同核化学位移相关谱 异核化学位移相关谱 NOESY和化学交换 3 多量子谱 multiplequantumspectroscopy 用脉冲序列可以检测出多量子跃迁 得到多量子二维谱 4 2化学位移相关谱 CorrelatedSpectroscopy COSY 二维化学位移相关谱包括同核化学位移相关谱 Homonuclearcorrelation 1 通过化学键 COSY TOCSY 2D INADEQUATE 2 通过空间 NOESY ROESY 异核化学位移相关谱 Heteronuclearcorrelation 强调大的偶合常数 1H 13C COSY强调小的偶合常数 压制大的偶合常数 COLOC 远程1H 13C COSY 4 2 1同核化学位移相关谱 一 COSY Correlatedspectroscopy 所谓的COSY系指同一自旋体系里质子之间的偶合相关 1H 1H COSY可以1H 1H之间通过成键作用的相关信息 类似于一维谱同核去偶 可提供全部1H 1H之间的关联 因此1H 1H COSY是归属谱线 推导结构及确定结构的有力工具 1 COSY 90 的基本脉冲序列包括两个基本脉冲在此脉冲作用下 根据发展期t1的不同 自旋体系的各个不同的跃迁之间产生磁化传递 通过同核偶合建立同种核共振频率间连接图 此图的二个轴都是1H的 在 1 2的对角线上可以找出一维1H谱相对应谱峰信号 通过交叉峰分别作垂线及水平线与对角线相交 即可以找到相应偶合的氢核 因此从一张同核位移相关谱可找出所有偶合体系 即等于一整套双照射实验的谱图 COSYof2 丁烯酸乙酯 2 COSY 45 基本脉冲 90 t1 45 ACQ 在COSY 90的基础上 将第二脉冲改变成45 许多的天然产物的直接连接跃迁谱峰在对角线附近 导致谱线相互重叠 不易解析 采用COSY 45 由于大大限制了多重峰内间接跃迁 重点反映多重峰间的直接跃迁 减少了平行跃迁间的磁化转移强度 即消除了对角线附近的交叉峰 使对角线附近清晰 3 相敏COSY谱 DQF COSY COSY谱 由于谱线信号色散分量作用 相邻的峰容易相互部分重叠 交叉峰的精细结构看不清楚 不便读出偶合常数 相敏COSY phasesensitive COSY 谱的相位很复杂 相位调节的质量直接影响偶合常数的检测即信号灵敏度 在COSY谱中对角线与交叉峰相位总是相差90 相敏COSY谱中 磁化转移地结果产生一对交叉峰相位相差180 以AX体系为例 其交叉峰为纯吸收线形 对角线为色散型 谱图黄色圆圈为正峰 红色为负峰 谱图正负峰以不同的颜色表示 下图蓝色圆圈为正峰 红色为负峰 也可以用实心表示正峰 空心表示负峰 其交叉峰为纯吸收线形 对角线为色散型从相敏COSY可以直接读出J值 这里需要辨认主动偶合和被动偶合 所谓的主动偶合就是相关交叉峰直接的偶合 其余为被动偶合 主动偶合的每一对峰总是一正一负 被动偶合的交叉峰是相位相同 同为正或同为负 A M X 与COSY有关的实验自旋回波COSY SECSY 双量子相干谱 DQC COSY 同核接力相干谱 RCT 有兴趣的同学 可以阅读有关的书籍 二 天然丰度的双量子13C谱INDEQUATE 13C 13C COSY 这是二维碳骨架直接测定法 是确定碳原子连接顺序的实验 一种双量子相干技术 是一种13C 13C化学位移相关谱 在质子去偶的13C谱中 除了13C信号外 还有比它弱200倍的13C 13C偶合卫星峰 13C 13C偶合含有丰富的分子结构和构型的信息 由于碳是组成分子骨架 它更能直接反映化学键的特征与取代情况 但是由于13C天然丰度仅仅为1 1 出现13C 13C偶合的几率为0 01 13C 13C偶合引起的卫线通常离13C强峰只有20Hz左右 其强度又仅仅是13C强峰的1 200 这种弱峰往往出现在强13C峰的腋部 加上旋转边带 质子去偶不完全 微量杂质的影响等因素 使1JC C测试非常困难 利用双量子跃迁的相位特性可以压住强线 突出卫线求出JC C 并根据Jc c确定其相邻的碳 一个碳原子最多可以有四个碳与之相连 利用双量子跃迁二维技术测量偶合碳的双量子跃迁的频率 13C 13C同核偶合构成二核体系 AX AB 两个偶合的13C核能产生双量子跃迁 孤立的碳则不能 它只有一个双量子跃迁 其频率正比于两个偶合的13C核的化学位移之和的平均值 所以如果两个碳具有相同的双量子跃迁频率 即可以判断 它们是相邻 在INADEQUATE谱图中F1与F2分别代表双量子跃迁频率和13C的卫线 依次代表双量子和单量子跃迁频率 谱图中一个轴是13C的化学位移 一个为双量子跃迁频率 其频率正比于两个偶合的13C核的化学位移之和的平均值 因此谱图中F1 2F2的斜线两侧对称分布着两个相连的13C原子信号 表示碳偶合对的单量子平均频率与双量子频率间的关系 水平连线表明一对偶合碳具有相同的双量子跃迁频率 可以判断它们是直接相连的碳 依此类推可以找出化合物中所有13C原子连接顺序 18 11 16 15 17 13 三 NOESY NuclearOverhauserEffectSpectroscopy 核间磁化传递是通过非相干作用传递 这种传递是靠交叉驰豫和化学交换来进行 即样品间偶极 偶极传递的 它的基本脉冲是 2 t1 2 tm 2 ACQNOESY的基本序列在COSY序列的基础上 加一个固定延迟和第三脉冲 以检测NOE和化学交换的信息 混合时间tm是NOESY实验的关键参数 tm的选择对检测化学交换或NOESY效果有很大影响 选择合适的tm 可在最后一个脉冲 产生最大的交换 或建立最大的NOE NOESY的谱图特征类似于COSY谱 一维谱中出现出现NOE的两个核在二维谱显示交叉峰 NOESY可以在一张谱图上描绘出分子之间的空间关系 COSYOFPBF NOESYofPBF COSY Codeine的NOESY 6 7 3 5 9 10 12 11 Codeine在高场放大的NOESY 13 13 18 18 16 17 17 11 14 8 7 127 18 18 3 5 105 11 16 18 9 10 17 17 10 1611 18 16 14 18 18 13 18 16 14 1713 14 17 17 13 17 17 17 17 TableofNOEs 相敏NOESY 与COSY类似 NOESY也适用于相敏形式 在这种相敏谱上 分辨率高 容易辨认信号峰 而且谱线比非相敏形式的谱线狭窄 从而限制了假峰的产生 有效增加了灵敏度 phase sensitiveNOESYofstrychnine 四 TOCSY TOCSY脉冲序列 是一种旋转坐标系实验 自旋锁定实验 自旋锁定是把COSY序列中的第二脉冲以及NOESY序列中最后两个脉冲 包括混合时间 用一个长射频脉冲取代 把自旋沿着旋转坐标系的一个锁定 在这种情况下不存在化学位移差 通过发生标量偶合的磁化转移 导致了全部相关 TOCSY也有称之为HOHAHA 可以提供自旋系统中偶合关联信息 HOHAHA是通过交叉极化产生Hartmann Hahn能量转移 从而观察较低旋磁比核一种方法 它是通过增加混合时间 使一个质子的磁化矢量将重新分布到同一偶合网络的所有质子 得到多次的接力信息 由于增加混合时间 灵敏度降低 为了解决这一问题 采用高分辨相敏方法 交叉峰和对角峰都是吸收型 特别适用于具有独立自旋体系的大分子 可进一步判断证实COSY中因信号严重重叠而造成的不确定结果 选择适当的参数可通过一次实验得到独立自旋体系所有质子相关信息 2d HOHAHA的特点是 通过改变t1测定 将同核Hartmann Hahn跃迁信号沿化学位移二维展开 并用一个脉冲序列测得多重接力COSY 在复杂偶合体系1H信号归属于解析中 而且在肽类 核苷 蛋白质等发挥巨大的作用 质子a b candd构成自旋体系既一个偶合网络系统 CH3CH2构成另外一个网络系统 这是两个独立的自旋体系 COSYspectrum CH2a与CH2b 相关而在TOCSYspectrum 它不仅显示与质子b相关 而且也与itwouldalsoshowcorrelationsto两个 CH2 candd 相关 TOCSYofcodeine COSY TOCSY 3 9 10 12 11 18 16 13 14 13 18 3 16 3 5 3 16 3 9 5 3 10 3 10 3 5 ROESY CAMELSPIN 若采用一个弱自旋锁场 则在旋转坐标体系中产生交叉驰豫NOE 得到ROESY谱 RotatingNOE 即旋转坐标系中的NOE增强谱 又称之CAMELSPIN谱 它类似于NOESY 能提供空间距离相近的核的相关信息 它的基本序列与TOCSY相似 但采用低功率自旋锁场 可由连续波照射或一系列小脉冲角脉冲组成混合脉冲 基本序列 2 t1 CW X ACQ ROESY与NOESY区别 NOESY在分子量大和小的分子体系中 灵敏度很高 小分子的快速运动 产生NOE 大分子的或降温产生负NOE 而中等分子 300 1500 或特殊形状分子 在NOESY中得不到交叉峰 而ROESY交叉峰与分子量的大小无关 由于ROESY是低的功率实验 可以检测到小的相互作用 4 3异核化学位移相关谱 HeteronuclearCorrelationofchemicalshift 所谓异核化学位移相关谱是两个不同核的频率通过标量偶合建立起来的相关谱 应用最广泛的是1H 13CCOSY 1 1H 13CCOSY 常规的1H 13CCOSY是指直接相连的C H之间的偶合相关 1JCH 基本脉冲 该实验的关键是选择一个适合的混合期 以使13C核和氢核的信息充分转移 即选择合适的 1 2 1H 13C COSY谱图中F2为13C化学位移 F1为1H化学位移 没有对角峰 其交叉峰表明C H偶合的信息 解析时 可以从一已知的氢核信号 根据相关关系 即可找到与之相连的13C信号 反之亦然 可以从谱图中得到1JC H的结构信息 13C 1HCOSY2 丁烯酸乙酯 A D C B 7 78 157 47 5 111 6 120 6 122 6 127 2 COLOC CorrelationSpectroscopyvialongrangecoupling 和1H 13C COSY序列基本一样 只是在COLOC谱中的 1 2对应于远程C H偶合常数nJ 2JCH 3JCH 而不是1JCH 得到一键以上的CH偶合相关信息 建立C C之间的关联 可以跃过N O等其它官能团 成为推导结构归属信号 解决由于屏蔽效应难以解决的季碳归属的有力工具 由于该方法能够将季碳和相邻碳的质子相关 对于确定C C连接非常有效 常规的1H 13C COSY没有季碳和其它质子的相关峰 COLOC谱图类似于C H COSY 两个坐标 F1 F2 是化学位移 交叉峰也类似于C H COSY 只是出现了小偶合的相关峰 COLOC最大的缺点是相关峰中包含所有的1JCH信号 解析谱图时一定要对照C H COSY 确定1JCH 分辨出2JCH 3JCH 7 78 157 47 5 127 122 6 120 6 111 6 A D C B 7 78 157 47 5 7 78 157 47 5 111 6 120 6 122 6 127 0 7 7 d 1H J 9 0 H 1 8 15 d 1H j 8 8Hz H 4 7 5 dd 1H J 9 0 0 8Hz H 3 7 4 dd 1H 8 8 1 2Hz H 2 111 6 d C 1 122 6 d C 2 127 0 d c 3 120 6 d c 4 156 2 s c 5 124 2 s c 6 4 4多量子跃迁谱 常见的核磁是选择 m 1的单量子跃迁 在偶极相互作用及其影响下 自旋体系的能级不再由单一态波函数 而变成混合态 可能出现 m 0 2 3 的跃迁 称之为多量子跃迁 多量子跃迁指的是不满足选择 m 1跃迁 其中m表示体系的总磁量子数 它们按照 m 2 3 称为n量子跃迁 而不问具体含几个跃迁 产生的多量子跃迁不能直接观察到 要把它变回可观察的单量子跃迁才能进行检测 得到S t1 t2 后经过傅立叶变换得到频率谱 常见的多量子跃迁谱有HMQC HMBC 与1H 13CCOSY COLOC谱相似 由于多量子相干转移 使其灵敏度大大提高 对于测定时间相等的条件下所需的样品量为 INADEQUATE200mg 400mM 1H 13CCOSY5 10mg 20mM COLOC5 10mg 20mM HMQC1mg 5mM HMBC2 3mg 7mM 因此这两种方法为分子量大的微量样品的测定提供了广阔的前景 1 HMQC 1 bondCHcorrelation 1H检测的异核多量子相干谱 HMQC是将1H信号的振幅及相位分别依13C化学位移及1H间的同核化学偶合信息调制 并通过直接检测调制后的1H信号 获得13C 1H化学位移相关数据 它所提供的信息及谱图与1H 13CCOSY完全相同 及图上的两个坐标分别是1H 13C化学位移 直接相连的13C与1H将在对应的13C化学位移与1H化学位移的交点处给出相关信号 不能得到季碳的结构信息 HMQCofCodeine HSQC DEPT 这个实验有一个变化 显示CH2与CH CH3有不同的相位 CH2显示负的相位 在下图中用红色表示 在Codeine中的三个CH2很容易辨认 这种技术称之为HSQC DEPTspectrum HSQC DEPTofCodeine HMBC multiple bondCHcorrelation HMBC是一种测定远程1H 13C相关的十分灵敏的方法 它给出远程1H 13C相关信息 特别是适用于检测与甲基有远程偶合的碳 2JCH 3JCH 其基本原理是 通过1H检测异核多量子相干调制 选择性地增加某些碳信号的灵敏度 是孤立的自旋体系相关联 而组成一个整体分子 对于质子相隔两个 三个键 2JCH 3JCH 的碳 提供了有效的相关信息 抑制了直接偶合的1JCH信号强度是谱图简化 该法适用于具有众多甲基地天然产物 如三萜化合物 甾醇化合物的结构鉴定 HMBC可高灵敏度地检测13C 1H远程偶合 2JCH 3JCH 因此可得到有关季碳的结构信息及其被杂原子切断地1H偶合系统之间的结构信息 红线表示芳环H 8对C 1和C 6 三键偶合 和一个弱偶合C 2 二键偶合 H 7 与C 2andC 4 三键偶合 在此图中 显示的是脂肪氢与芳环碳的偶合相关 在左下角显示甲氧基与C 2的三键偶合 表明芳环碳上连接甲氧基 H 18两个质子与C 7和C 4相关 三键偶合 与C 6相关 两键偶合 H 17toC 4 相关 这是脂肪氢与脂肪碳的偶合相关H 11toC 14and orC 15H 18toC 16 C 11H 13toC 17 C 14and orC 15 C 11H 14toC 13andC 11H 18 toC 11H 17toC14and orC 15 C 13 H 11toC 14and orC 15H 18toC 16 C 11H 13toC 17 C 14and orC 15 C 11H 14toC 13andC 11H 18 toC 11H 17toC14and orC 15 C 13 2 27 3H s 2 CH3 2 65 3H s 5 CH3 5 98 1H d J 0 6Hz H 3 6 61 2H m H 6 8 10 57 1H s 7 OH 10 57 169 2 C 2 116 1 C 3 183 7 C 4 146 9 C 5 121 9 C 6 166 3 C 7 105 9 C 8 164 5 C 9 119 6 C 10 24 7 2 CH3 27 8 5 CH3 DEPT 解析1 不饱和度 11 5 1 7 4对sp2杂化碳 一个酮羰基 有两个环结构 2 分子的对称性从13CNMR谱图看有11个信号 表明分子没有对称性 3 根据DEPT确定化合物的碳的原子级数有二个甲基 C24 7 27 8 三个sp2杂化烯CH碳 105 9 116 1 121 9 剩下6个碳为季碳 一个羰基4 官能团的分析从氢谱2 27 3H s CH3 2 65 3H s CH3 5 98 1H d J 0 6Hz 6 61 2H m H 6 8 10 57 1H brs OH 10 57 1H s OH 是一个酚羟基 从5 98 1H d J 0 6Hz 6 61 2H m 存在弱偶合 J 0 6 表明存在四取代的苯环而且苯环两个氢处于间位 化合物中苯环有6个碳 有一个羰基 2个甲基 还剩下一对sp2杂化碳 酮羰基化学位移值为183 7可能含有 不饱和酮 从氢谱质子分析是一个三取代的双键 5 排出可能的结构分析169 2 166 3 164 5三个季碳化学位移分子其中一个氧原子连接两个sp2杂化烯CH碳 化合物中有两个环结构 可以排出如下结构 可能的结构 根据DEPT实验结果169 2 166 3 164 5都是季碳可以排出后四种可能 剩下下面四种 C 121 9 与C 105 9 为苯环上处于间位的两个叔碳 6 61 又因为此二碳都与酚羟基氢H 10 57 1H s OH 相关 故酚羟基不可能处于5位或8位 这样 只可能为两种结构 2 5 二甲基 7 羟基色原酮或2 8 二甲基 6羟基色原酮 H 2 27 3H s 2 CH3 2 65 3H s 5 CH3 5 98 1H d J 0 6Hz H 3 6 61 2H m H 6 8 10 57 1H s 7 OH C 169 2 C 2 116 1 C 3 183 7 C 4 146 9 C 5 121 9 C 6 166 3 C 7 105 9 C 8 164 5 C 9 119 6 C 10 24 7 2 CH3 27 8 5 CH3 C 10 5 6 NMRAssignment Example IPSENOL Unknown Ipsenol C10H18O IndexofHdeficiency C H 2 1 2 C13NMRandDEPT CHonly C C C O C C Unknown Ipsenol 5aliphaticcarbons 2Methyls1CH2CH21CH O deshielded 4Olefiniccarbons 2 CH21 CH1 C C10H18O IndexofHdeficiency C H 2 1 2 In13C Allcarbonsarevisible nosymmetry Counting protonsattachedtoCarbon 17H TheoneMissingmightbeattachedtoHeteroatom OH ProtonSpectra Integration 1H 4H Olefinic1CH 2CH2 1H CH O Aliphatic 6H 2MeTriplet 6H 1CH 2CH2OH HETCOR o CH O Me o CH CH O CH ProtonSpectra Expansion 2xd ddd ddd m OH dd dd Septet dd d CH2 COSY x o ProtonSpectra Analysis 2 1 3 4 5 6 7 8 6 1 1 1 2 3a 3b 4 5a 5b 7cis trans 8t 8c 6 H4 notseptet tt HMBC Example Caryophylleneoxide Unknown Caryophylleneoxide C15H24O IndexofHdeficiency C H 2 1 4 C13 NMRandDEPT CHonly CH CH3 CH2 C CH2 C13 NMR Inolefinicregion C CH2Inaliphaticregion3Methyls3CH5CH22quaternary 60and24ppm1CH O 63ppm In13C Allcarbonsarevisible nosymmetry C15H24O IndexofHdeficiency C H 2 1 4 Counting protonsattachedtoCarbon 24HAllprotonsareaccountedfor H NMR C15H24O CH2 AllprotonsareattachedtoCarbon Oxygenmustbeether nocarbonylfromC 13 noalcohol InNMRnoverydeshieldedprotonorcarbon epoxyde HMQC CH CH2 CH2 H NMR CH dd q Methyl t CH2 CH2 HETCOR CH2 H NMR assignment dd q Methyl t CH2 CH2 COSY COSYexp HMBC CH2 C CH2 HMBCexp C HMBCexp C C Structure C15H24O C AllcarbonsareaccountedforaswellasHydrogens OnlyOremain INADEQUATE 1JC C CH2 INADEQUATE 1JC C C C2 C2 C Me CH 利用二维核磁共振推导未知化合物的结构1 确定化合物的分子式 计算不饱和度 2 官能团推导 3 氢谱与碳谱信号的指认4 结构片断的推导5 结构片断的连接6 立体化学的确定7 归属化合物的信号验证结构 例如1 下面未知化合物的分子式是C25H28O5 根据下面的核磁谱图推导化合物的结构 DEPT 2 56 2 60 2 30 1 46 1 79 1 89 7 31 6 86 COSY HMQC 94 5 6 103 1 4a 161 8 5 H 3 196 8 78 7 130 8