分子诊断技术的临床应用.pptVIP

分子诊断技术的临床应用 狭义的分子诊断是基于核酸的诊断技术 是通过对DNA或RNA的检测来实现对疾病的检测和诊断 但是 随着第一张人类基因组测序图的完成 以及由此而带来的基因组学 蛋白组学 代谢物组学等新兴学科的发展 分子诊断的内涵已经从单纯的DNA RNA拷贝 突变等变化的检测 拓展到核酸与DNA片段 蛋白与多肽 抗原与抗体 受体与配体等生物大分子的检测 并广泛应用于疾病的筛查 诊断 治疗监测 预后与预防等生命科学的各个领域 一 分子诊断的概念 根据分子诊断技术特征划分为三类 一 基于分子杂交为基础的分子诊断技术两条同源核酸分子 DNA或RNA 可以在碱基互补的原则下形成异质双链是遗传物质最重要的化学特征 这一过程亦被称为分子杂交 分子杂交是所有分子生物学技术的基础 从最初的印迹杂交到聚合酶链反应 PCR 从基因芯片再到高通量的DNA测序技术 都离不开碱基互补的分子杂交反应 二 基于测序技术为基础的分子诊断技术DNA的序列分析是分子诊断学的金标准 各种遗传疾病 病毒或细菌的感染与变异 在基因表达水平上的个性化用药 多基因疾病的诊断与预测 最终都可以借助基因测序平台的应用 三 基于扩增技术为基础的分子诊断技术1983年Mullis发明了聚合酶链反应 Polymerasechainreaction PCR 使体外扩增DNA成为可能 开启了体外扩增和操作DNA或RNA技术的发展 到现在 扩增DNA的技术已经成为分子诊断应用最广的技术之一 并发展变化了数十种核酸扩增检测技术 二 PCR概述 一 PCR概念PCR PolymeraseChainReaction 即聚合酶链反应 是指在DNA聚合酶催化下 以母链DNA为模板 以特定引物为延伸起点 通过变性 退火 延伸等步骤 体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程 是一项体外核酸扩增技术 能快速特异地在体外扩增任何目的DNA PCR技术能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍 使肉眼能直接观察和判断 可从一根毛发 一滴血 甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定 二 PCR概述 九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开1998年荧光定量PCR技术开始在中国应用于临床检测 PCR发展简史 1983Mullis于12月16日成功发明了PCR1985关于PCR的文章首次由Mullis及其同事等人在 Science 杂志上发表198912月 Science 杂志将PCR和它所使用的TaqDNA聚合酶命名为第一个 年度分子 199310月13日Mullis获诺贝尔化学奖 1995荧光定量PCR技术出现 PCR技术 PCR核心技术是从水栖高温菌中分离到能耐高温的Taq酶 使扩增反应不需要每一个循环加一次DNA聚合酶 从而实现了自动化 使应用领域迅速扩大 PCR技术成为了分子生物学中的一项突破性技术 PCR概述 2000至2013年发表论文篇 二 PCR概述 二 原理双链DNA变性退火延伸 膜板 双链分成单链 膜板与引物杂交 DNA合成 不断重复 PCR循环次数与DNA产量关系 高灵敏度高特异性简便快捷高效扩增 忠实复制 PCR反应的特点 三 荧光定量PCR技术的临床应用 病毒性肝炎 HBV HBV YMDD HCV 的基因检测性病相关病原体 CT NG UU HPV HIV 的基因检测优生优育项目诊断 人巨细胞病毒 HCMV 单纯疱疹病毒 HSV 弓形虫 TOX 风疹病毒 RUB 其它病原体检测 结核杆菌 肺炎支原体 EB病毒 伤寒杆菌 幽门螺旋杆菌等 一病原体检测 常规结核病实验室诊断方法及不足 1 痰涂片作抗酸染色 阳性率低 费时2 细胞培养 金标准 周期太长 4 8W 3 血清学诊断 a 接种BCG可出现阳性b 不能区分活动性结核病和治愈后留下损伤灶的病人c 交叉反应 假阳性不能早期诊断 容易漏诊 误诊 荧光定量PCR检测TB DNA的意义 1 能稳定检测10copy的TB DNA 灵敏度高 特异性强2 早期 快速 准确地诊断结核病 痰液 肺及支气管灌洗液 肺结核血液 播散性结核和各脏器的结核病脑脊液 中枢神经系统结核病宫颈拭子 尿道拭子 泌尿生殖道结核病 3 荧光定量PCR检出结核杆菌阳性率显著高于痰涂片抗酸染色和改良罗氏培养法 4 TB DNA浓度可用于判断疗效 痰标本中结核杆菌的数量呈逐渐下降趋势 TB DNA拷贝数下降 根据病原体DNA浓度 对药物治疗及疗效观察提供参考依据 荧光定量PCR检测TB DNA的意义 二肿瘤相关基因表达的检测 1 包括癌基因 抗癌基因2 肿瘤转移基因3 转移抑制基因 三 荧光定量PCR技术的临床应用 三遗传病1 等位基因检测2 多基因遗传病的突变检测3 基因表达异常所致遗传病检测 三 荧光定量PCR技术的临床应用 四其它应用1 法医学鉴定2 抗病毒药物疗效的观察 指导3 缩短诊断的窗口期 三 荧光定量PCR技术的临床应用 窗口期 所谓 窗口期 是指从感染病原体开始 直至用某种检测方法能够检测到该病原体存在为止的这一段时间 美国90 以上输血传播HIV和HBV以及75 以上输血HCV的危险性均来自 窗口期 感染献血 提供直接证据缩短 窗口期 PCR检测的临床意义 RNA Ab P24 Ab 血清阳转后的方法 RNA p24 Ab 血清阳转 抗体检测临界值特异性抗体比例 时间 反应指标 感染 血清阳转前的方法 怎样检测HIV早期感染 婴幼儿感染HIV诊断 12月内核酸检测 13 17月先抗体 阳性者检测核酸 18个月以上抗体检测 四 PCR检测的标本采集要求 五 NAT 核酸检测 技术类型 实时荧光核酸恒温扩增检测技术 SAT 实时荧光核酸恒温扩增检测技术 SAT 是将核酸恒温扩增和实时荧光检测相结合的一种新型核酸检测技术 国内公司 上海仁度生物科技有限公司 自主研发 拥有一整套自主知识产权和核心技术 SAT 技术原理 同一温度下 42 以RNA为起始模板 通过M MLV反转录酶产生一个双链DNA拷贝 然后利用T7RNA多聚酶从DNA拷贝上产生多个 100 1000个 RNA拷贝 每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环 同时 带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合 产生荧光 该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获 直观反映扩增循环情况 SAT检测技术的优势 检测靶标 RNA灵敏度高 特异性强 易鉴别死菌 活菌 适合临床判愈 扩增产物 RNA高效扩增 低污染 核酸提取 磁珠法提取纯度高结果准确 检测方法 实时荧光检测 扩增 检测同时进行全程监控 扩增方式 42 恒温无需热循环 设备成本低 总结 分子诊断技术经历近30年的快速发展 已经形成了主要以杂交 测序和扩增三种反应模式为主的测试技术群 并且在临床诊断中获得了广泛的应用 原位杂交为主的技术对于检测基因表达异常的遗传性疾病具有明显的优势 已成为细胞遗传学实验室最有力的检测工具之一 而全基因组测序技术的快速发展 使得高通量的测序方式来检测全基因的表达差异或突变检测的成本均大大降低 而且测试速度将逐渐适合临床的需求 因此对于大量基因的表达和突变检测 高通量测序技术的优势将会越趋明显 另一方面 RT PCR STA等PCR技术对于感染性疾病 低突变位点或变异的检测 在成本上明显优于前两者 因此PCR技术可能在临床上拥有更好的应用空间 不同的技术平台有各自的优缺点 我们要针对不同的实验标本对象及需求 选择适合的技术方法 力求在 高效 高质量 低成本 这三者间找到合适的平衡点 分子诊断学的快速发展 得益与分子诊断技术的日新月异 1990年启动的人类基因组计划