MZ27--李海红--酶工程.doc

扬州大学研究生课程论文课程名称： 酶工程 论文题目： 浅谈微生物蛋白酶的生产进展 姓 名： 李海红 学 号： MZ13827 专 业： 食品工程 2013 年 11月 12日浅谈微生物蛋白酶的生产进展摘要：蛋白酶是生物有机体的必须物质，大量的存在于植物、动物和微生物中。由于微生物遗传物质的敏感性，微生物蛋白酶的存在相当广泛。就酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶以及低、高温蛋白酶的生产和菌种研究进展进行了概述。关键词：酸性蛋白酶；中性蛋白酶；碱性蛋白酶Progress on microbial protease productionAbstract:Proteases are physiologically necessary for living organisms and are ubiquitous, being found in a wide diversity of sources such as plant, animals and microorganisms. Among these sources, microbial proteases represent excellent sources of enzyme owing to their susceptibility to genetic manipulation.This article has summarized the research process and production of the acid protease, neutral protease, alkaline protease,and high and low temperature protease.Key words:acid protease;neutral protease; alkaline protease1 前沿 蛋白酶是催化蛋白质水解的一类酶, 主要用于洗涤剂,制革、毛皮、蛋白水解物、酿酒、酱油,以及纺织、医药品、化妆品等的生产和生物材料的提取上是，酶学研究中较早也是最深入的一种酶。生物体的生理活动和疾病的发生, 如食物的消化吸收、血液凝固、溶血作用、消炎、血压调节、细胞分化自溶、机体衰老、癌症转移以及生理活性肤的活化等, 莫不与蛋白酶有关1。蛋白酶也与人类生活资料的生产息息相关,涉及人类生活的方方面面, 全球酶制剂市场中蛋白酶的销售额占60%。蛋白酶的广泛使用不仅简化了有关行业的生产工艺,节约了投资,降低了原材料消耗,提高了产品得率与质量,对改善环保减少二氧化碳排放也作出了积极的贡献。蛋白酶的分类方法有多种,按活性中心可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、天门冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶四大类。以最适pH分为碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶。蛋白酶主要存在于人和动物消化道中，在植物和微生物中含量丰富。例如，胃蛋白酶是优良的消化药，它的获取可以从动物的胃粘膜中提取，有研究者用双水相萃取和壳聚糖沉淀相结合分离猪胃蛋白酶获得了很好的效果2；植物蛋白酶多采用硫酸铵沉淀法进行提取3,4。由于动植物资源有限，工业上生产蛋白酶制剂主要利用枯草杆菌、栖土曲霉等微生物发酵制备5。2 蛋白酶的生产能生产蛋白酶的微生物很多,但所用菌种必须符合FAO/WHO食品添加剂专家委员会JECFA 的评估标准,在美国酶制剂生产菌种须符合GRAS要求。细菌的中性蛋白酶和碱性蛋白酶通常是用液体深层培养法生产,而酸性蛋白酶如霉菌蛋白酶则更适于采用固体培养法生产,固体培养不易污染,容易管理,节省能源,单位容器产量高。在两种培养方式下,同一菌种所产蛋白酶即使在相同活性水平下,有时固体培养的实用效果更好。固体培养物经过辐照或环氧乙烷灭菌处理,视用途不同而可直接作为粗酶来使用以降低成本, 例如用作饲料添加剂或用于制革工业。 微生物生产蛋白酶与生长相有关,芽孢杆菌中性蛋白酶在对数生长期与细胞生长同步产生,而碱性蛋白酶则在对数生长期末芽孢形成时大量生成,芽孢形成起到产酶的触发作用。不能形成芽孢的突变株一般不能大量合成碱性蛋白酶,丧失蛋白酶合成能力的突变株不能形成芽孢。曲霉固体培养时,蛋白酶活性在分生孢子老熟时达到最大值,液体培养时当菌体衰老自溶时,蛋白酶活性达到高峰。影响微生物蛋白酶生产的因素十分复杂,同一微生物因培养条件不同可产生多种蛋白酶。根据Tabandeh的最新研究培养基不同对蛋白酶的产量影响显6。蛋白酶是一诱导酶,其生物合成受底物及其类似物之诱导,也受到氨基酸或铵盐等易利用氮源之阻遏，钙离子对蛋白酶的生物合成和稳定都很重要。微生物的产酶能力通过各种遗传育种手段已得到大幅度提高，基因工程改良菌种是当前最热衷的课题,工业用酶的80%已是用基因改良菌种生产的,食品工业用的产酶菌种人们还是希望是采用诱变育种手段获得。2.1 酸性蛋白酶 酸性蛋白酶是指在pH值偏酸性范围内水解蛋白质肽键的酶类。酸性蛋白酶首先由日本吉田文彦于1954 年首先所报道,其产品Molsin在1963年问世。酸性蛋白酶生产菌有黑曲霉、斋滕曲霉、栗疫霉 、米赫毛霉 、丝立毛霉、根霉等。Siala, R等研究人员对在虾蛋白胨上培养黑曲霉产蛋白酶的条件进行了优化，得出了最适产酶条件7。开始生产的酸性蛋白酶只是工业级的，主要用皮毛的软化。微生物菌种通过液体通风发酵，成熟发酵醪再经硫酸铵盐析，板框压滤，气流（沸腾）干燥，粉碎，化验，包装制成工业级粉剂酸性蛋白酶。食品级酸性蛋白酶前发酵与工业级相同只是后提取不同，成熟发酵醪进入絮凝罐，加入絮凝剂絮凝沉淀再经板框压滤机压滤，滤饼经干燥后可作饲料酶添加剂，滤清液经超滤膜浓缩器浓缩经化验合格，加入防腐剂、稳定剂就是成品的浓缩酸性蛋白酶制剂。酸性蛋白酶活力是指1g固体酶粉或1mL液体酶，在40OC和pH3.0条件下，1min水解酪蛋白产生1ug酪氨酸即为一个酶活力单位。蛋白酶可经过二次盐析、层析或透析方法提高酶的比活力。浓缩酶经载体，如食用级淀粉吸收干燥后，在常温下可长时间存放不失活。2.2 中性蛋白酶中性蛋白酶是指在pH值偏中性范围（6.0-7.5）内水解蛋白质肽键的酶类。大多数微生物中性蛋白酶是含金属元素，部分蛋白酶含有一分子锌，起着酶同底物之间的桥梁作用，有些酶的分子中含有若干原子钙，钙离子能增加中性蛋白酶的稳定性8。中性蛋白酶生产菌有枯草芽孢杆菌、热介蛋白芽孢杆菌 、厌色链霉菌、蜂蜜曲霉等。虽然可以从自然环境中分离筛选得到具备产酶能力的产酶菌株，但是要达到中性蛋白酶的大量积累，则需要对菌株进行改良，解除或者突破微生物的代谢调控。实际工业化生产上所使用的菌株，仍然是多采用一些传统诱变技术。诱变育种是以强烈的物理及化学因素处理微生物细胞，促使细胞中的 DNA 结构发生变化，引起诱发突变，进而设法从大量的变异群体中筛选出具有优良性状的突变株。诱变育种具有速度快、收效大、方法简单等特点。随着分子生物技术的广泛应用，中性蛋白酶的分子生物学研究逐步兴起，至今已经克隆出多种不同微生物来源的中性蛋白酶基因,并在细菌及酵母等各种宿主菌中得到了表达。目前,商业上所用的中性蛋白酶大部分来源于芽孢杆菌属。Beigi9等在大肠杆菌中表达 SVP2 的研究中,发现通过响应面优化发酵条件（包括培养温度、蛋白胨浓度、酵母粉浓度、接种量、IPTG 浓度、诱导时间和钙离子浓度)后蛋白酶产量能达到522U/mL。2.3 碱性蛋白酶 碱性蛋白酶(Alkaline protease)是指在pH值偏碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类，1913年Rohm首先将胰蛋白酶作为洗涤浸泡剂使用，1945年瑞士Dr.Jaag等人在地衣芽孢杆菌中发现了碱性蛋白酶。碱性蛋白酶是国内研究得较为广泛和深入的一个酶制剂，1965 年上海合成洗涤剂厂从进口洗衣粉首先分离出地衣芽孢杆菌2709，在复旦大学新型发酵厂的协作下，对发酵条件进行研究后，于1971年投入生产，产品除用于加酶洗衣粉外，还用于制革脱毛和毛皮的软化。碱性蛋白酶生产有液化淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、黄曲霉、米曲霉、栖土曲霉、冠状耳霉、酱油曲霉等。由于微生物蛋白酶均为胞外酶,与动、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单、价格低廉、来源广、菌体易于培养、产量高、高产菌株选育简单快速、具有动植物蛋白酶所具有的全部特性,且相对中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力,有较大耐热性且有一定的醋酶活力,易于实现工业化生产。 高产碱性蛋白酶菌株的选育主要通过基因工程技术和蛋白质工程手段进行工业微生物菌种的定向选育，目的性强。崔洪霞等人从海泥中分离并通过优化发酵条件得到了一株高产碱性蛋白酶海洋细菌10。高产菌株的选育有物理、化学因子诱变，原生质体技术选育碱性蛋白酶高产菌株，利用基因工程技术选育高产菌株，蛋白质工程技术选育高产菌株的选育和空间诱变技术。2.4 低温蛋白酶和耐高温蛋白酶 来自低温环境的微生物从大类群上包括细菌、酵母菌、霉菌、微藻等。由于生理上独特的适应性和大分子结构方面特殊性(包括细胞膜脂质的特殊性、酶分子结构的柔性以及冷激蛋白、低温保护剂分子的快速合成)，这些微生物能够在低温环境中生存、繁衍11。这些微生物分泌的胞外酶在低温下和中度温度下有较高的催化活性，在温度适当提高后就可以使这些低温酶失活，因此这些酶不仅在低温环境有机质的循环中发挥着重要的生态学作用。低温蛋白酶是一个相对概念，其最适作用温度通常比同功能的中温(50)蛋白酶要低20 30左右，且在较低的温度下(0 20)拥有较高的酶活性，而在高温条件下( 60)的酶活性较差12。徐宇丽等人对冰川沉积的产酶菌进行了分离和分子生物学的研究，分离的同属细菌菌株相互之间的16S rRNA基因序列同源性也在97%-98%13,14。层正是由于这些特点使得低温蛋白酶在食品加工业、冷水洗涤剂、动植物抗冻、医用疫苗以及生物保鲜方面有着普通中高温蛋白酶无法取代的优越性。 高温蛋白酶是一种具有独特酶学性质最适温度在60oC以上的酶类产品，主要来源于极端环境中的细菌、霉菌和酵母菌等微生物，由于所处环境的特殊性，该类蛋白酶往往在极端温度和pH值下以及一系列较强的抑制剂和氧化剂存在的条件下具有较高的酶学活性和稳定性。高温碱性蛋白酶的热稳定性首先被认为是因为其具有紧密的晶体结构。Rosenbaum等15发现，来源于一株火球菌(Pyrococcus horikoshii)的四面体的(tetrahedral, TET)蛋白酶为十二聚体，构成四面体结构，每一个四面体的顶点包含一个催化空间，各有3个活性位点。Bajaj等通过研究Streptomyces sp. DP2产生的高温碱性蛋白酶的构象发现，高温碱性蛋白酶往往形成一个更为严密的分子内结构，表现为解折叠的熵和构象应变释放速率减少，使其在高温、变性剂条件下保持较高的稳定性16。高温碱性蛋白酶在医药工业、化学工业以及环境保护中都有着重要的应用。3 小结 蛋白酶的生产技术已经相当成熟，要想得到更加有应用前景的酶就要在菌种上多做研究。随着基因工程技术研究的深人和应用技术手段的完善,利用基因工程手段和蛋白质工程手段定向改造以提高碱性蛋白酶产生菌产酶活力及酶学性质是今后很长时间的一个发展趋势。利用工业废弃物产酶，工业废弃物作为发酵产酶的培养基成分，也是研究的一个热点，如Haddar17发现菌株Bacillus Licheniformis RP1能以虾废水作为唯一的碳氮源，发酵产蛋白酶。在今后的一段时间里我国蛋白酶研究方向主要是继续运用基因工程技术和蛋白质手段进一步提高目前工业微生物菌种产酶能力和酶的特性，选育极端碱性蛋白酶产生菌,如低温蛋白酶产生菌、耐高温蛋白酶。综上所述,碱性蛋白酶研究是一个富有前景的领域,同时,也相信随着碱性蛋白酶研究的进一步深人,碱性蛋白酶将会成为一个新的经济增长点。参考文献：1Kinch,LisaN,Grishin,Nick V.Bioinformatics perspective on rhomboid intramembrane protease evolution and functionJ.Biochimica et biophysica acta,2013,1818(12):2937-2943.2董娜,董文宾,田颖.双水相萃取和壳聚糖沉淀相结合分离猪胃蛋白酶J.食品科技,2011,36(1):26-29.3Chaurasiya, RS,Hebbar, HU.Extraction of bromelain from pineapple core and purification by RME and precipitation methodsJ.Separation And Purification Technology,2013,111:90-97.4Ketnawa S,Chaiwut P,Rawdkuen S.Aqueous Two-phase Extraction Of Bromelain From Pineapple Peels (Phu Lae cultv.) And Its Biochemical PropertiesJ.Food Science And Biotechology,2011,20(5):1219-1226.5Kumari Kiran SP,Satyavani Y.Production of protease Enzyme using various sourcesJ.Research Journal Of Biotechology,2012,7(4):250-258.6Tabandeh F.,Hosseinian Moghaddam H.R.,et al.Fed-batch fermentation of Bacillus clausii forefficent production of alkaline protease using different feeding strategiesJ.Chemical Engineering Communications,2011,198(9):1063-1074.7Siala, R.,Mhamdi, S.,Nasri, M.,et al.Optimization of acid protease production by aspergillus niger I1 on shrimp peptone using statistical experimental designJ.Scientific World Journal,2012,20(2):564-575.8McConn JD,Tsuru D,Yasunobu KT.Bacillus subtilis neutral proteinaseJ.The Journal of Biological Chemistry,1964,239(11)：3706-3715.9Beigi L.,Karbalaei-Heidari H.R.,Kharrati-Kopaei M.Optimization of an extracellular zinc-metalloprotease (SVP2) expression in Escherichia coli BL21 (DE3)using response surface methodology J. Protein Expression and Purification, 2012,84(1):161-166.10崔洪霞,李春林,钱龙,孙滢等人.一株高产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选及发酵条件的优化J.燕山大学学报,2013,37(1):88-94.11Margesin R,Miteva V.Diversity and ecology of psychrophilic microorganisms.Research in Microbiology,2011,162 (3) :346-361.12Dastager SGA,Dayanand WJ.Li CJ,Kim JC,Lee DJ,Park XP,Tian,Raziuddin QS.Proteolytic activity from an alkali-thermotolerant Streptomyces gulbargensis.Current Microbiology,2008,57 (6) :638-642.13Xu Y,Wang D,Shi X,Zheng X,Zhou H,Liu Ya,NiY.Selective isolation and diversity of cold-adapted lipaseproducing strains from permafrost soil at the terminus of a glacier in the Tianshan MountainsJ.Acta MicrobiologicaSinica,2011,52 (2) :233-24014Zhang M,Gu Y,Xu Y,Shi X,Zheng X,Zhou H,NiY.hylogenetic and physiological diversity of coldadapted bacteria producing -galactosidase from permafrost sediments o