培养基配方及配制方法.doc

培养基配方1 斜面菌种保存培养基1.1PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸0.5h，纱布过滤，滤液补足1000ml，再加15g葡萄糖和15-20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml（视试管大小而定），121灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。1.2麦芽汁琼脂培养基麦芽汁的制备：干麦芽首先进行粉碎（不能太粗，也不必太细。太粗影响糖化效率，过细影响过滤速度），按麦芽重量的34倍加水，搅拌均匀后，37左右浸泡1小时，然后缓缓加温至5563（在升温过程中应不断搅拌使温度均匀），保温46小时（用0.02摩尔/升碘液测定为黄色至无色时），糖化结束。在糖化过程中，应每小时搅拌一次。取过滤后的清液，加1.8%琼脂，分装试管，每试管约5-10ml（视试管大小而定），121灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。2 基菌落总数检测2.1平板计数琼脂培养基将胰蛋白胨5.0g、酵母浸膏2.5g、葡萄糖1.0g、琼脂15.0g加入蒸馏水1000ml中，煮沸溶解后，调pH，然后在121下灭菌15min，取出，稍微冷却后，带热倒入培养皿中。3志贺氏菌检测3.1 GN增菌液成分：胰蛋白胨：20g，葡萄糖：1g，甘露醇：2g，柠檬酸钠：5g，去氧胆酸钠0.5g，磷酸二氢钾4g，磷酸氢二钾1.5g，氯化钠5g，蒸馏水1000ml。pH7.0制法：将上述物品加入蒸馏水中，加热溶解煮沸，调pH为7.0，分装，在115高压灭菌15min。3.2 HE琼脂成分：胨：12g，牛肉膏3g，乳糖12g，蔗糖12g，水杨素2g，胆碱20g，氯化钠5g，琼脂1820g，蒸馏水1000ml0，0.4%溴麝香草酚蓝溶液16ml，Andrade指示剂20ml.，甲液20ml，乙液20ml。pH7.5制法：将上述前七种成分加入400ml蒸馏水中作为基础液，将琼脂加入到600ml蒸馏水中加热溶解，加入甲液乙液到基础液中，调pH，再加入指示剂，并与琼脂液合并，待冷却至5055，倾注浇平板。注1：此培养基不能高温灭菌。注2：甲液的配置：硫代硫酸钠：34g，柠檬酸铁钠：4g，蒸馏水：100ml。注3：乙液的配置：去氧胆酸钠：10g，蒸馏水：100ml。注4：Andrade指示剂的配置：酸性复红：0.5g，1mol/l的氢氧化钠溶液：16ml，蒸馏水：100ml。将酸性复红溶解于蒸馏水中，加入氢氧化钠溶液，数小时后如复红褪色不全，再加氢氧化钠溶液12ml。3.3 SS琼脂3.3.1 基础培养基：成分：牛肉膏：5g，胨：5g，三号胆盐：3.5g，琼脂：17g，蒸馏水：1000ml。制法：将牛肉膏蛋白胨，三号胆盐加入到400ml蒸馏水中，将琼脂加入到600ml蒸馏水中，煮沸使其溶解，然后液混合，于121下灭菌15min，保存备用。3.3.2 完全培养基成分：基础培养基：1000ml，乳糖：10g，柠檬酸钠：8.5g，硫代硫酸钠：8.5g，10%柠檬酸铁溶液：10ml，1%中性红溶液：2.5ml，0.1%煌绿溶液：0.33ml。制法：加热融化基础培养基，按比例加入处染料以外的所有成分，搅拌均匀，调pH7.0，加入中性红溶液和煌绿溶液，混合均匀后浇平板。注1：配制好的培养基宜当日使用，或保存于冰箱48h内使用。注2：煌绿溶液配好后，应在10日内使用。注3：可以购买SS琼脂的干燥培养基。3.4 麦康凯琼脂成分：蛋白胨：17g，胨：3g，猪胆盐（牛、羊胆盐）：5g，氯化钠：5g，琼脂：17g，蒸馏水：1000ml，乳糖：10g，0.01%结晶紫水溶液：10ml，0.5%中性红水溶液：5ml。制法：将蛋白胨、胨、猪胆盐、氯化钠溶解于400ml蒸馏水中，调pH7.2，将琼脂加入到600ml蒸馏水中加热溶解，将两液混合均匀，于121下灭菌15min备用。临用时加热融化琼脂，趁热加入乳糖，等冷却到5055时，加入结晶紫和中性红水溶液，搅拌均匀后浇平板。注：结晶紫和中性红水溶液配好后，须经高压灭菌。3.5 伊红美蓝琼脂（EMB）成分：蛋白胨：10g，乳糖：10g，磷酸氢二钾：2g，琼脂17g，2%伊红Y溶液：20ml，0.5%美蓝溶液：10ml，蒸馏水1000ml，pH7.1。制法：将蛋白胨、磷酸盐、琼脂溶解于蒸馏水中，调pH，于121下灭菌15min备用。临用时加热融化琼脂，并加入乳糖，冷却至5055时加入伊红和美蓝溶液，混合均匀后浇平板。3.6 三精铁琼脂成分：蛋白胨：20g，牛肉膏：5g，乳糖：10g，蔗糖：10g，葡萄糖：1g，氯化钠：5g，六水硫酸亚铁铵：0.2g，硫代硫酸钠：0.2g，琼脂：12g，酚红：0.025g，蒸馏水：1000ml，pH7.4。制法：将除琼脂和酚红以外的各种成分溶解于蒸馏水中，调pH，然后加入琼脂，加热溶解，加入0.2%酚红水溶液12.5ml，摇匀，分装时量多一点，于121下灭菌15min，搁高层斜面备用。3.6葡萄糖半固体发酵管成分：蛋白胨：1g，牛肉膏：0.3g，氯化钠：0.5g，1.6%溴甲酚紫酒精溶液：0.1ml，葡萄糖：1g，琼脂：0.3g，蒸馏水：100ml，pH7.4。制法：将蛋白胨，牛肉膏，氯化钠加入水中，调pH后，加入琼脂，煮沸溶解，再加入指示剂和葡萄糖。分装，于121下灭菌15min，备用。3.7 半固体管成分：蛋白胨：1g，牛肉膏：0.3g，氯化钠：0.5g，琼脂：0.350.4g，蒸馏水：100ml，pH7.4。制法：将上述成分溶于水中，加热煮沸，并调pH后分装小试管，121高压灭菌15min，直立凝固备用。3.8 尿素琼脂成分：蛋白胨：1g，氯化钠：5g，葡萄糖1g，磷酸二氢钾：2g，0.4%酚红溶液：3ml，琼脂：20g，蒸馏水：1000ml，20%尿素：100ml，pH7.20.1。制法：将除尿素和琼脂以外的成分配好，调pH，加入琼脂后加热使其溶化并分装小瓶，121高压灭菌15min，冷却至5055后，加入经过滤灭菌的尿素溶液，最终尿素浓度为2%，最终的pH应为7.20.1。分装于灭菌试管内，搁斜面备用。3.9 西蒙氏柠檬酸盐琼脂成分：氯化钠：5g，七水硫酸镁：0.2g，磷酸二氢铵：1g，磷酸氢二甲：1g，柠檬酸钠：5g，琼脂：20g，蒸馏水：1000ml，0.4%溴麝香草酚蓝溶液：40ml，pH6.8。制法：先将盐类溶解于水中，调pH，再加琼脂，加热溶化，然后加入指示剂，混合均匀后分装试管，121下灭菌15min，搁成斜面。实验方法：挑取少量琼脂培养物接种，于361培养4天，每天观察结果，阳性者斜面上有菌落生长。培养基由绿色转为蓝色。3.10 氰化钾（KCN）培养基成分：蛋白胨：10g，氯化钠：5g，磷酸二氢钾：0.225g，磷酸氢二钠：5.64g，蒸馏水：1000ml，0.5%氰化钾溶液：20ml，pH7.6。制法：将除氰化钾以外的成分配好分装，121灭菌15min，放在冰箱内使其充分冷却，每100ml培养基加入0.5%氰化钾溶液2.0ml（最后浓度为1:10000），分装于12mm100mm灭菌试管，每管约4ml，立刻用橡皮塞塞紧，放在4冰箱内，至少可保存两个月，同时将不加氰化钾的培养基作为对照培养基，分装备用。试验方法：将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成作为稀释菌液，挑取1环接种于氰化钾培养基，另外挑取1环接种于对照培养基，在361下培养12天，观察结果，如有细菌生长，则为阳性，经2天后不生长则为阴性。注：氰化钾是剧毒物质，使用时应小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行，实验失败的主要原因是封口不严，氰化钾逐渐分解，变成氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低，细菌生长，造成假阳性现象。3.11 氨基酸脱羧酶实验培养基成分：蛋白胨：5g，酵母浸膏：3g，葡萄糖：1g，蒸馏水：1000ml，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液：1ml，L-氨基酸或DL-氨基酸：0.5g或1g/100ml，pH6.8。制法：除氨基酸以外的所有成分加热溶解后，分装每瓶100ml，分别加入各种氨基酸：赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。L-氨基酸按0.5%加入，DL-氨基酸按1%加入。再调pH6.8，对照培养基不加氨基酸。分装于灭菌的小试管内，每管0.5ml，上面滴加一层液体石蜡。115高压灭菌10min。实验方法：从琼脂斜面上挑取培养物接种，于361下培养1824h，观察结果，氨基酸脱羧酶阳性者由于产碱，培养基应呈紫色。阴性者因为碱性物质产生，但因葡萄糖产酸而是培养基变成黄色，对照管应为黄色。3.12 蛋白胨水（靛基质试验用）成分：蛋白胨或胰蛋白胨：20g，氯化钠：5g，蒸馏水：1000ml，pH7.4制法：将上述成飞混合均匀，分装小管，121灭菌15min。靛基质试剂：柯凡克试剂：将5g对二氨基甲醛溶于75ml戊醇中，然后慢慢加入浓盐酸25ml。欧-波试剂：将1g对二氨基苯甲醛溶于90ml95%的乙醇内，然后慢慢加入浓盐酸20ml。实验方法：挑取少量接种物接种，在361下培养12天，必要时可培养45天，加入柯凡克试剂约0.5ml，轻摇试管，阳性者试剂层呈深红色，或加入欧-波试剂，沿管壁流下，覆盖于培养液表面，阳性者接触面上呈玫瑰红色。注：蛋白胨应含有丰富的色氨酸，每批蛋白胨买来后应用已知菌种实验。3.13 糖发酵管成分：牛肉膏：5g，蛋白胨：10g，氯化钠：3g，十二水磷酸氢二钠：2g，0.2%溴麝香草酚蓝溶液：12ml，蒸馏水：1000ml，pH7.4。葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121灭菌15min。其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100ml，121灭菌15min，另将各种糖类配好10%溶液，一同灭菌，将5ml糖溶液加入到100ml液体培养基中，以无菌操作分装小试管。注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。实验方法：从琼脂斜面