RT-PCR基本步骤.doc

实时荧光定量PCR原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。1内标在传统定量中的作用由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异,因此无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。2实时荧光定量PCR无需内标实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。 RT-PCR步骤总RNA提取1. 取200mg组织，放到1.5ml EP管中，加入1ml Trizol剪碎。2. 震荡30s。3. 加0.2ml氯仿，剧烈摇动30s，室温3min。 4. 12000g，4 离心，15min。5. 吸上层无色水相，移入另一EP管中（约0.5ml）。6. 加等体积异丙醇，-20，30min。7. 12000g，4 离心，10min。在管底部可见微量RNA沉淀8. 弃上清，加75乙醇1ml，振荡。9. 7500g，4 离心，10min。10. 弃上清，用滤纸小心吸取残留液体，室温干燥510min。11. 沉淀溶于20l DEPC水，取1l加入79l DEPC水测OD260/OD28012. 计算浓度与纯度，70保存。 OD26040稀释倍数RNA浓度（g/l） 1000逆转录合成 cDNA 反应体系如下 MgCl2 2l 10RT Buffer 1l RNase Free dH2O 3.75l dNTP Mixture(各10mM) 1l RNase Inhibitor 0.25l AMV Reverse Transcriptase 0.5l Random 9 mers 0.5l Positive Control RNA (1g) 1l混匀快速离心一次反应条件如下 30 10min 42 30min 99 5min 5 5min -20 冰箱冻存 PCR反应 摸板cDNA 2.5l 5PCR Buffer 2.5l 灭菌蒸馏水 7.2l 聚合酶 Ex Taq HS 0.1l 上游引物 0.1l 下游引物 0.1lTotal 12.5l混匀快速离心一次反应条件 94 2min 1Cycle 94 40sec 50-65 40sec 25-35Cycles 72 1min 72 5min 1Cycle PCR产物-20冰箱保存取