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现代医学仪器 第三章第六节血细胞分析仪 BloodCellAnalyzer 南京医科大学第一临床医学院临床医学工程处刘坚 血细胞分析仪概述 血细胞分析仪 BloodCellAnalyzer 是指对一定体积全血内血细胞异质性进行自动分析的常规检验仪器 血液分析仪主要完成以下两大功能 血细胞计数 红细胞 白细胞 血小板 血红蛋白 血细胞分类 白细胞中的淋巴 中性 嗜酸 嗜碱 单核 幼稚细胞 红细胞中的网织红细胞 根据计数 分类的测定值计算间接测定值红血球容积比 HCT 平均红血球血红蛋白含量 MCH 血小板容积比 PCT 等等 血细胞分析仪概述 1947年Coulter发明了小孔电阻抗法通过测量细胞的体积大小对细胞进行分类计数主要是用来计数红 白细胞该技术一直被各种血液分析仪沿用至今1953年库尔特家族研制出全世界第一台血细胞计数仪 ModelA WallaceH JosephR Coulter 血细胞分析仪概述 血细胞计数 Bloodcount 早期的血液分析仪主要用来计数红 白细胞全血细胞计数 CompleteBloodcellCount 增加光电比色系统用来同时测定血红蛋白血小板可在同一仪器上与红细胞一起计数利用直接测量到的项目运算得到间接计算项目 如血球压积等参数 不包括白细胞分类计数测定标本采用机外人工处理的预稀释方式 血细胞分析仪概述 白细胞分类计数 DifferentialLeukocyteCellCount 带电脑的显微镜下辨认细胞的图象识别技术效率低 受制片 染色技术的影响大在计数细胞数不多时 重复性较差没有得到普遍推广阻抗法仪器检测白细胞 二分群 三分群 仪器内部结构的进一步完善微处理器分辨力的进一步提高特殊溶血剂的应用无法对细胞内部结构进行分析 准确性有限 白细胞分类计数 DifferentialLeukocyteCellCount 检测白细胞从二分群 三分群发展到五分群除了体积测量之外增加了多种手段 联合检测法 激光散射 激光激发荧光检测法射频 高频 传导检测法特殊溶血剂检测法多角度激光 偏振光散射检测法细胞化学染色检测法在实际仪器中至少采用两种以上方法联合对白细胞进行五分类 血细胞分析仪概述 血细胞分析仪概述 白细胞分类计数 DifferentialLeukocyteCellCount 五分群血液分析仪提供四十余项实验参数全血细胞计数 CBC 白细胞总数 WBC 红细胞 RBC 红血球容积比 HCT 血红蛋白 HGB 平均红血球体积 MCV 血小板 PCT 平均红血球血红蛋白含量 MCH 白细胞分类 DIFF 淋巴细胞 LYM 中性粒细胞 NEUT 单核细胞 MONO 嗜酸细胞 EOS 嗜硷细胞 BASO 网织红细胞分类 计数 RETIC 五分群血液分析仪的基本检查项目 血细胞分析仪分型 按自动化程度分类 半自动血细胞分析仪 全自动血细胞分析仪 血细胞分析工作站 血细胞分析流水线 按检测原理分类 电容型 光电型 激光型 电阻抗型 联合检测型 干式离心分层型 无创型 按对白细胞分类的水平分类 二分群 三分群 五分群 五分群 网织红 红细胞 小孔电阻抗法是利用血细胞混悬液中血细胞的电阻大于电解液溶液 稀释液 电阻的特性 当血细胞通过小孔时引起小孔两端电阻抗增大的原理而进行血细胞计数和体积测定 小孔电阻抗法能够进行白细胞 红细胞 血小板计数及体积的测定 小孔电阻抗法在对白细胞分类上只能将白细胞按体积大小分为三个亚群 故分析精度较差 164页 测定原理 Principle 电阻抗法 小孔阻抗法 白细胞三分群 小孔电阻抗法基本原理 采用Coulter原理 即小孔电阻抗法装有宝石小孔的小孔管置与小孔管内外的铂金电极两电极间的恒流电源小孔上端的恒定负压 小孔电阻抗法基本原理 测定原理 Principle 电阻抗法 小孔阻抗法 白细胞三分群 测定原理 Principle 电阻抗法 小孔阻抗法 白细胞三分群 血细胞通过小孔 排开等体积电解液 小孔中的电解液电阻变大 引起产生等比例增大的电压脉冲 电压脉冲的个数与细胞个数相当 脉冲幅度与细胞体积成正比 将脉冲送入相应的计数通道 计算得到某类细胞个数 小孔电阻抗法基本原理 测定原理 Principle 由检测器产生的脉冲信号经计算机处理后以体积直方图显示 直方图可以显示特定细胞群中的细胞体积和细胞分布情况 164页 通道内计数 白细胞 三分群 型血液分析仪 小孔电阻抗法基本原理 256个计数通道1 6fl 每通道 1fl 1立方微米 10 15升 由检测器产生的脉冲信号经计算机处理后以体积直方图显示 直方图可以显示特定细胞群中的细胞体积和细胞分布情况 在进行血细胞分析时 白细胞和血红蛋白为一个检测通道 小孔直径为100 m 红细胞和血小板为一个检测通道 小孔直径为70 m 小孔电阻抗法基本原理 测定原理 Principle 电阻抗法 小孔阻抗法 白细胞三分群 白细胞的五种类型 小孔电阻抗法基本原理 正常人外周血中的5种白细胞 最多的是嗜中性 次为淋巴细胞 其他3种在通常情况下加起来不超过10 淋巴细胞与嗜中性细胞体积相差较大 其他3种体积相差不多 测定原理 Principle 白细胞及血红蛋白检测 白细胞的计数与分类 白细胞 血红蛋白通道 血液样品 稀释液 溶血剂 白细胞的计数与分类血红蛋白测定 白细胞 血红蛋白通道 血液样品 稀释液 溶血剂 转化剂 氰化血红蛋白氰化血红蛋白浓度 血红蛋白浓度 比色法测量 小孔电阻抗法基本原理 测定原理 Principle 白细胞及血红蛋白检测 由于血小板的体积小于红细胞 两者在同一测量通道中进行 由于血液中红细胞的总数远大于白细胞 检测样品经二次稀释后直接进入小孔计数 检测结果同样以直方图形式显示 小孔电阻抗法不能对红细胞中的网织红细胞进行测量 小孔电阻抗法基本原理 测定原理 Principle 红细胞及血小板检测 单纯依靠细胞体积大小来进行白细胞五分类是难以做到的 必须采用一些其他检测手段联合应用来进行白细胞五分类 联合检测型 常用方法有 高频电磁波 或称射频 传导法细胞化学染色法特殊溶血剂法激光散射法 测不同角度的散射及激发光 其白细胞总数 红细胞 血小板及血红蛋白的测定方法仍基本沿用 三分类 型分析仪的方法 联合型检测法基本原理 测定原理 Principle 联合型检测法 白细胞五分群 绝大多数五分类血细胞分析仪在检测通道上都采用了流式细胞分析技术 流式细胞分析技术的检测光路可分为鞘流通道 激发光源 多为激光 散射光检测 吸收光检测 荧光检测等几个方面 在白细胞五分类型血液分析仪中对网织红细胞一般也采用单独的激光流式细胞分析通道进行检测 测定原理 Principle 联合型检测法 白细胞五分群 联合型检测法基本原理 五分类血细胞分析仪白细胞分类结果均采用散点图的形式来显示 红白细胞总数血小板仍采用直方图显示 联合型检测法基本原理 测定原理 Principle 散点图 Scattergram 联合型检测法基本原理 白细胞二维散点图 二维散点图及直方图 测定原理 Principle 散点图 Scattergram 图中纵坐标为体积 横坐标为吸光度 各种不同类型的白细胞根据其体积与吸光度的的数值标记在二维坐标的相应位置 联合型检测法基本原理 测定原理 Principle 散点图 Scattergram 联合型检测法基本原理 图中三维坐标分别为V C S 各种不同类型的白细胞根据其VCS的值 标记在三维坐标的相应位置 白细胞三维散点图 测定原理 Principle 散点图 Scattergram 1 电阻抗 DC 高频传导 RF 和激光散射 Scatter 联合检测法 即所谓 VCS技术 Coulter公司 V代表体积 Volume 采用电阻抗法计数血细胞和测量其体积 C代表传导性 Conductivity 主要测量细胞内部的结构 细胞内核浆比例 质粒的大小和密度 GEN SSystem 1 电阻抗 DC 高频传导 RF 和激光散射 Scatter 联合检测法 即所谓 VCS技术 Coulter公司 S代表散射 Scatter 用于测量细胞表面不同的结构及颗粒 单一通道上同时用这三种方法对同一白细胞进行测量 在三维的图像上将各细胞较好地分开 准确分类 TotalCellVolume CoulterPrinciple DirectCurrent 细胞体积 ConductivityPrinciple HighFrequencyCurrent 核 浆比例 颗粒 LightScatterPrinciple Laser 细胞表面特征 细胞体积 2 激光散射和细胞化学染色联合检测法 Bayer公司ADVIA120 Abx公司Pentra120 稀释液中加入髓过氧化物酶 MPO 的底物 过氧化氢和色原可使含MPO的细胞胞浆染色 由于不同种类白细胞含MPO不同 因此可以通过染色的深浅加以区别 加入特殊溶血剂使得除嗜碱细胞以外的细胞全部裸核化 ADVIA120 2 激光散射和细胞化学染色联合检测法 Bayer公司ADVIA120 Abx公司Pentra120 用两个流式通道进行测定 髓过氧化物酶通道 卤素灯光源 测吸光度与散射光 嗜碱性 核叶通道 激光光源 测高角度散射光与低角度散射光 通道还同时进行红细胞 血小板及网织红细胞的测定 Pentra120 3 多角度激光偏振光散射检测 电阻抗联合检测法 Abbott公司CD 3500 完全用激光散射方法进行白细胞分类 其测散射光所用的角度为四个 即0o 10o 90o和90o消偏振 depolarized 电阻抗法用于计数白细胞总数 CELL DYN3500 3 多角度激光偏振光散射检测 电阻抗联合检测法 Abbott公司CD 3500 完全用激光散射方法进行白细胞分类 其测散射光所用的角度为四个 即0o 10o 90o和90o消偏振 depolarized 电阻抗法用于计数白细胞总数 CELL DYN3500 4 电阻抗和射频传导联合检测 特殊溶血剂法 Sysmex公司NE 8000 SE 9000 淋巴细胞 单核细胞和中性粒细胞检测通道 DC RF 嗜碱性细胞检测通道 特殊溶血剂 嗜酸性细胞检测通道 特殊溶血剂 幼稚细胞检测通道 硫化氨基酸 SE 9000 计数网织红细胞的方法 在红细胞稀释液中加入可染RNA的荧光染料 经激光激发后在检测器中加以计数 各公司生产的仪器计数网织红细胞时基本都采用这种方法 多数仪器中网织红细胞的测定使用单独的激光检测通道 不少仪器生产厂家将此功能做成独立仪器或选购件供用户选择 血细胞分析仪检测流程 血细胞分析仪工作流程图 维护工作的基本要点电路系统 仪器供电电压 各种传感器状态 流体系统 各种管道 电磁阀 正负压力 机械运动 加样针 注射器 旋转阀 比色通道 光源灯 滤光片 维修软件 各点电压检测 运动部件检测 基本要点可能因为各种仪器的型号不同而不尽适用 可依据具体情况来分别对待 但经过仔细观察和深入了解一定可以掌握对自己使用的机型的基本维护 现代医学仪器 第三章第七节流式细胞分析仪 Flowcytometer 南京医科大学第一临床医学院临床医学工程处刘坚 流式细胞分析仪概述 流式细胞分析仪 flowcytometer 是集计算机技术 电子物理技术 光电测量技术 激光技术 流体力学技术 细胞化学技术 细胞免疫学技术于一体的高科技细胞分析仪 流式细胞术 FlowCytometry 是利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数 快速 每秒可达1000 10000个 的定量分析和分选 纯度可达99 以上 的技术 流式细胞仪在细胞生物学 免疫学 肿瘤学 血液学 病理学 遗传学 临床检验等学科中得到广泛应用 流式细胞仪基本原理 待测标本制备成单细胞悬液通过荧光染色后加压进入充满鞘液的流动室 鞘液压力与样品流压力差异达到一定比例时 鞘液包裹着样品流中细胞排成单列逐个经过激光聚焦区 通过激光检测区的细胞受激光照射 产生散射光 部分被标上特异性荧光染料的细胞 产生特定波长的荧光 流式细胞仪基本原理 通过一定波长选择通透性的滤光片 将散射光 不同波长的荧光信号区分开来 并送到不同的光电检测通道 经过一系列信号转换 放大 数字化处理 就可以在计算机上直观的得到染上各种荧光染料的细胞各自的百分率 细胞分选功能可以将具有某种特征的细胞分选出来 以便进一步培养 研究 流式细胞仪基本结构 一 流动室及液流驱动系统 二 激光光源及光束形成系统 三 光学系统 透镜 滤光片 小孔 聚焦光源 收集不同波长的荧光信号 四 信号检测与存储 显示 分析系统 光电倍增管 PMT 补偿电路 荧光信号转换为电信号 并将信号放大 五 细胞分选系统 FCM基本结构图解 流式细胞仪基本结构 流动室及液流驱动系统 流动室与液流驱动系统 空气泵压力传感器压力调节器石英流动室 流式细胞仪基本结构 流动室及液流驱动系统 空气泵压力传感器压力调节器石英流动室 流式细胞仪基本结构 激光光源及光束形成系统 氩离子激光器 Argon 半导体激光器 He Ne 紫外UV激光器 He Cd 按功率大小可分为水冷 空冷到达流动室前经透镜聚焦 流式细胞仪基本结构 激光光源及光束形成系统 氩离子激光器 Argon 半导体激光器 He Ne 紫外UV激光器 He Cd 按功率大小可分为水冷 空冷到达流动室前经透镜聚焦 流式细胞仪基本结构 光学系统 透镜 滤光片 小孔 聚焦光源 收集不同波长的荧光信号 流式细胞仪基本结构 光学系统 透镜 滤光片 小孔 聚焦光源 收集不同波长的荧光信号 LP 长通滤光片 SP 短通滤光片 BP 带通滤光片 DLP DSP双色性长通短通滤光片 流式细胞仪基本结构 光学系统 透镜 滤光片 小孔 聚焦光源 收集不同波长的荧光信号 流式细胞仪基本结构 信号检测与存储 显示 分析系统 光电倍增管 PMT 补偿电路 荧光信号转换为电信号 并将信号放大 前向角散射光检测 FSC 采用光电二极管侧向角散射光检测 SSC 采用光电二极管荧光检测 FL 采用光电倍增管 流式细胞仪基本结构 信号检测与存储 显示 分析系统 光电倍增管 PMT 补偿电路 将荧光信号转换为电信号 并将信号放大 处理分析 Log 荧光信号的线性测量与对数测量荧光信号的面积测量与宽度测量荧光光谱的重叠校正 流式细胞仪基本结构 信号检测与存储 显示 分析系统 光电倍增管 PMT 补偿电路 将荧光信号转换为电信号 并将信号放大 处理分析 荧光信号的线性测量与对数测量荧光信号的面积测量与宽度测量荧光光谱的重叠校正 流式细胞仪基本结构 信号检测与存储 显示 分析系统 光电倍增管 PMT 补偿电路 将荧光信号转换为电信号 并将信号放大 处理分析 数据存储采用列表排队方式数据显示通常有一维直方图二维散点图 等高线图 密度图等 流式细胞仪基本结构 信号检测与存储 显示 分析系统 光电倍增管 PMT 补偿电路 将荧光信号转换为电信号 并将信号放大 处理分析 数据存储采用列表排队方式数据显示通常有一维直方图二维散点图 等高线图 密度图等 SS FS 流式细胞仪基本结构 细胞分选系统 捕获管分选和静电分选水滴形成部件分选逻辑电路水滴充电及偏转 捕获管分选 流式细胞仪基本结构 细胞分选系统 捕获管分选和静电分选水滴形成部件分选逻辑电路水滴充电及偏转 细胞分选系统 捕获管分选和静电分选水滴形成部件分选逻辑电路水滴充电及偏转 流式细胞仪主要性能指标 流式细胞仪可分为科研型 大型机 和临床型 台式机 两种类型 流式细胞仪主要性能指标 流式细胞仪可分为科研型 大型机 和临床型 台式机 两种类型 流式细胞仪主要性能指标 流式细胞仪可分为科研型 大型机 和临床型 台式机 两种类型 流式细胞仪主要性能指标 流式细胞仪可分为科研型和临床型两种类型 台式机 流式细胞仪主要性能指标 流式细胞仪可分为科研型 大型机 和临床型 台式机 两种类型流式细胞仪会在硬件上不断更新 采用更新的器件 如半导体激光 大规模集成电路 以实现小型化 用数字电路取代模拟电路 充分发挥微处理器的功能以实现简单化 在软件上提高数据自动分析能力 充分发挥图形界面的优点 使操作更加简便 流式细胞仪主要性能指标 流式细胞仪可分为科研型 大型机 和临床型 台式机 两种类型流式细胞仪会在硬件上不断更新 采用更新的器件 如半导体激光 大规模集成电路 以实现小型化 用数字电路取代模拟电路 充分发挥微处理器的功能以实现简单化 在软件上提高数据自动分析能力 充分发挥图形界面的优点 使操作更加简便 谢谢 流式细胞仪小结174页 待测标本制备成单细胞悬液通过荧光染色后加压进入充满鞘液流的流动室 细胞染色 鞘液流压力与样品流压力差异达到一定比例时 鞘液包裹着样品流中细胞排成单列逐个经过激光聚焦