SOP-C SDS-PAGE凝胶电泳标准操作规程.doc

文件名称SDS-PAGE凝胶电泳标准操作规程文件编号生效日期有效期至审批及颁发：部 门签 名日 期起 草质量部审 核质量部批 准质量受权人颁 发质量部会审：部 门签 名日 期部 门签 名日 期分发：Copy-1Copy-2Copy-3Copy-4Copy-5Copy-6Copy-7Copy-8Copy-9Copy-10Copy-11Copy-12Copy-13Copy-14Copy-15一、 目的建立重组人生长激素电泳检查标准操作规程，使中间产品检验有据可依。二、 范围适用于本公司中间产品“重组人生长激素” 的电泳检查。三、 职责1 质量部负责制定本规程。2 QC人员负责按照本操作规程的规定操作，并做好记录。3 QC室主任负责监督QC人员按照本规程的规定操作实施。四、 术语无五、 内容1 仪器、设备恒压电源、垂直板泳槽和制胶模具。2 试剂2.1 检查所需试剂是否在有效期内，未准备好的及时配制，缺少的试剂及时申购。2.2 所需试剂有：2.2.1 水：电阻率应不低于18.2M.cm。2.2.2 A液：（ 1.5mol/L三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液） 称取18.15g三羟基氨基甲烷，加适量水溶解，用盐酸调pH值至8.8，加水稀释至100ml。2.2.3 B液：30%丙烯酰胺-0.8%N，N-亚甲基双丙烯酰胺溶液（避光保存）。2.2.4 C液：1%十二烷基磺酸钠溶液。2.2.5 D液：10%四甲基乙二胺溶液。2.2.6 E液：10%过硫酸铵，临用前配置。2.2.7 F液：（0.5mol/L三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液） 称取6.05g三羟基氨基甲烷加适量水溶解，用盐酸调pH值至6.8，加水稀释至100ml。2.2.8 电极缓冲液：称取3g三羟基氨基甲烷，14.4g甘氨酸，1g十二烷基磺酸钠，加适量水溶解，用盐酸调PH值至8.3，加水稀释至1000ml。2.2.9 供试品缓冲液：称取0.303g三羟基氨基甲烷，0.189ml盐酸，4ml甘油，2mg溴酚蓝，0.8g十二烷基磺酸钠，加水溶解并稀释至10ml，此溶液用于非还原SDS-PAGE。如用于还原SDS-PAGE，则再加2ml-巯基乙醇。2.2.10 固定液：取量250ml乙醇,60ml冰醋酸,加水稀释至500ml。2.2.11 考马斯亮蓝染色液：称取1g考马斯亮蓝R250，加乙醇200ml，冰醋酸50ml，加水至500ml，混匀。2.2.12 考马斯亮蓝脱色液：取乙醇400ml、冰醋酸100ml，加水至1000 ml，充分混合。2.2.13 考马斯亮蓝保存液：取冰醋酸75ml，加水至1000ml，摇匀。3 方法3.1 原理大多数蛋白质与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。3.2 凝胶的制备凝胶种类分离胶浓缩胶凝胶浓度5. 0%75%10. 0%125%15. 0%175%45%试液/mlA液4. 04. 04. 04. 04. 04. 0B液274. 054678. 094135C液16161616161609D液010101010101007E液010101010101007F液225H2O736. 0488332880884333.2.1 制备分离胶溶液按上表15或12.5%制成分离胶溶液，灌入模具内至一定高度，加水封顶，室温下聚合（室温不同，聚合时间不同）。3.2.2 制备浓缩胶溶液：待分离胶溶液聚合后，用滤纸吸去上面的水层，再灌入浓缩胶（配方见上表），插入样品梳，注意避免气泡出现。3.2.3 凝胶保存凝胶应在室温条件下聚合，可在室温或2-8冰箱保存一周，如遇胶体失水严重，应重新配制。3.3 样品处理3.3.1 发酵液：取发酵液1.5ml于1.5ml离心管中， 10000rpm/min离心10min，弃去上清，留沉淀，再加入1ml 10mmol T.E ，充分混匀，将其稀释3倍（1倍样品加2倍水），取样20ul与还原样品缓冲液20ul置于0.5ml离心管中，混匀，置沸水浴中煮10min到15min后与对照品于同一块胶上样。3.3.2 中间产品：3.3.2.1 DEAE： 将上样液和下样液放在同一块胶上，根据紫外测定浓度结果，各上样量均为40ug，加入非还原缓冲液20ul，混匀，置沸水浴中煮5 min到8 min后上样。3.3.2.2 phenyl： 将上样液、穿液和下样液放在同一块胶上，根据紫外测定浓度结果，各上样量均为40ug，加入非还原缓冲液20ul，混匀，置沸水浴中煮5 min到8 min后上样。3.3.2.3 S-100： 将上样液和下样液放在同一块胶上，根据紫外测定浓度结果，各上样量均为80ug，加入非还原缓冲液20ul，混匀，置沸水浴中煮5 min到8 min后上样。3.3.2.4 DEAE： 将下样液放在同一块胶上，根据紫外测定浓度结果，各上样量均为80ug，加入非还原缓冲液20ul，混匀，置沸水浴中煮5 min到8 min后上样。3.3.3 筛种实验取发酵菌液1.5ml于1.5ml离心管中，10000rpm/min，离心10min，弃去上清，再加入1ml 10mmol T.E ，充分混匀，取样20ul与还原缓冲液20ul置于0.5ml离心管中，混匀，置沸水浴中煮10min到15min后与对照品于同一块胶上样。3.4 上样取出已配好的凝胶板，夹于电泳装置相应的位置上，取出样品梳，把画有样品槽性状的透明塑料片较切合地贴于凝胶板上，将电极缓冲液注满电泳槽前后槽，在供试品孔中加入样品，标注好各样品位置。3.5 电泳把电泳装置和电泳仪正确连接，冷凝水管与饮用水口连接，直至电泳结束。3.5.1 中间产品电泳：调电压150V，开始电泳，待蓝色条带泳动到底部时停止电泳。3.5.2 菌体电泳：调电压150V，开始电泳，待蓝色条带约泳动到浓缩胶与分离胶交接处时，调电压200V继续电泳，等蓝色条带到底部时停止电泳。3.6 凝胶处理3.6.1 固定：电泳完毕，取出胶片，置固定液中30分钟。3.6.2 染色：从固定液中取出胶片，置染色液中约1.5小时。3.6.3 脱色：用脱色液脱色至凝胶背景透明。3.6.4 保存：脱色完毕后，凝胶保存在保存液中。3.6.5 结果处理：待凝胶在保存液中完全透明后可使用凝胶成像系统对凝胶进行拍照，转换成电子数据后再进行进一步处理。3.6.6 永久保存：亦可制成干胶永久保存。六、 附录无七、 相关文件重组人生长激素中间产品质量标准重组人生长激素中间产品检验标准操作规程 电泳试验记录八、 参考文件 中国药典2010年版二部九、 培训要求1