磷酸果糖激酶研究进展

磷酸果糖激酶研究进展杨益坤 生命科学学院 SA16008074摘要：磷酸果糖激酶掌握着糖酵解开始的钥匙，是糖酵解中最重要的控制点。糖酵解速度主要取决于磷酸果糖激酶，它是个限速酶，其受多个途径调控：受ADP别构激活、ATP别构抑制；受柠檬酸、脂肪酸别构抑制；受果糖-2,6-二磷酸的调控；受H+抑制。生物体对磷酸果糖激酶的调控十分精细。对于磷酸果糖激酶的研究和应用主要在于对于糖尿病的治疗，磷酸果糖激酶的变构效应的研究，磷酸果糖激酶在糖酵解中的地位等等。本文就磷酸果糖激酶的研究进展进行综述。关键词：磷酸果糖激酶 别构激活 别构抑制 柠檬酸结合位点 乳酸 糖尿病 地位 一磷酸果糖激酶简介名称：磷酸果糖激酶（fructose-1,6-bisphosphate）磷酸果糖激酶1（Phosphofructokinase-1；PFK-1）是一种糖酵解作用里一种重要的酶，是一种由4个次单位组成的异位（allosteric）酵素，可受多种活化剂与抑制剂调控。糖酵解（glycolysis）是指在细胞质中将葡萄糖分解成为丙酮酸的过程，期间每分解一分子葡萄糖产生两分子丙酮酸以及两分子ATP。属于呼吸作用的第一个阶段，随后根据有氧与否将丙酮酸进行柠檬酸循环或发酵。在糖解作用里，PFK-1是负责将果糖-6-磷酸与ATP转变成为果糖-1,6-双磷酸与ADP。糖酵解过程中，6-磷酸果糖生成1，6-二磷酸果糖( Fructosel，6bisphosphate，F-1，6-BP)，催化此反应的酶是6-磷酸果糖激酶1(6-phosphofructokinase1，PFK1)，这是糖酵解途径的第二次磷酸化反应，需要ATP与Mg2+参与，G0=-14.2KJ/mol，反应不可逆。6-磷酸果糖激酶1是糖酵解过程的主要限速酶，是糖酵解过程中的主要调节点。至此，糖酵解完成了代谢的第一个阶段。催化反应：果糖-6-磷酸+ATP果糖-1,6-二磷酸+ADP辅助因子：Mg2+催化机制：镁离子将ATP外侧的两个磷酸基团作用，使磷原子更容易接受孤对电子的亲和进攻，使两个磷原子之间的氧桥所共用的电子对向氧原子一方转移，ATP的磷酸集团有利于氧桥断裂，并与果糖-6-磷酸分子结合，生成果糖-1,6-二磷酸。立体结构：每个PFK单体可以分为两个结构域，1和2。它们的空间位置可以用坐标系表示，结构域1从氨基酸的末端开始，包括五个折叠区域和五个螺旋区域。一个蛋白质单体在两个结构域中反复折叠。两个结构域自身都紧密装配，相互之间接触比较松散，形成一个深的裂缝。PFK的四个亚基中的每一个亚基都与其他两个亚基紧密接触，与第三个亚基的接触比较松散。每两个亚基形成一个超结构，而这样一个超结构与PFK的整体结构非常相似，因此，PFK在发展过程中保持了较为稳定的空间构象。二别构激活与别构抑制变构酶是体内一些代谢物可以与某些酶分子活性中心以外的某一部位可逆地结合，使酶发生变构并改变其催化活性，这种调节方式叫变构调节。受变构调节的酶叫变构酶。根据对反应速度的影响分为变构激活剂、变构抑制剂。变构酶常由多亚基构成，包括催化亚基和调节亚基。有多个亚基的酶存在协同应。ATP既可以作为反应底物又可以作为变构抑制剂，其原因在于：此酶有二个ATP结合位点，一个是与作为底物的ATP结合位点，另一个是与作为变构抑制剂的ATP结合位点，两个位点对ATP的亲和力不同，ATP与底物的ATP结合位点亲和力高，与变构抑制剂的ATP结合位点亲和力低。这样，当细胞内ATP不足时，ATP主要作为反应底物，保证酶促反应进行；当细胞内ATP较多时，ATP作为变构抑制剂，可降低6-磷酸果糖激酶1的催化活力。柠檬酸、脂肪酸就是通过加强ATP的抑制效应来抑制磷酸果糖激酶的活性，从而使糖酵解过程减慢。ATP水解掉一个磷酸之后形成ADP，ADP再水解释放一个磷酸之后形成AMP。因为1,6二磷酸果糖是6磷酸果糖激酶1的产物又是激活剂，相当于产物能加快自己的生成，所以叫正反馈。首先，6-磷酸果糖激酶-1是一个四聚体，它有2个结合ATP的位点，一是活性中心内的催化部位，ATP作为底物结合；另一个是活性中心以外的与变构效应剂结合的部位，与ATP的亲和力较低。6-磷酸果糖激酶-1有多种变构激活剂，2，6-二磷酸果糖是最强的是因为2，6-二磷酸果糖在生理浓度范围（u mol水平）内就可以发挥效应。2，6-二磷酸果糖的作用是与AMP一起取消ATP、柠檬酸对6-磷酸果糖激酶-1的变构抑制作用。三磷酸果糖激酶中柠檬酸结合位点的进化磷酸果糖激酶是依靠复杂方式来控制糖酵解，变构调节是调节催化作用的一种手段。对原核生物和真核生物的PFK进行序列分析表明，磷酸果糖激酶在两种不同的物种内的分歧是通过副本的变化和原核生物基因序列的变化引起的。 原核生物的磷酸果糖激酶的是真核生物的激酶大小的1/2，并且真核生物的磷酸果糖激酶的调控措施要远远多于原核生物。 在真核生物的磷酸果糖激酶中总共发现了六个关于酶活性的结合位点，催化ATP和果糖-6-磷酸的结合位点，激活剂结合位点，腺嘌呤核苷酸和果糖-1,6-二磷酸结合位点，以及ATP和柠檬酸盐的抑制性结合位点。但是，在磷酸果糖激酶的N-端的研究表明，只有一个活性位点在真核生物的N-端;而另一的方面，变构调节的配体发生了变化。导致这种现象发生的原因是磷酸果糖激酶C-端的变化使得酶蛋白可以为提高后续的代谢而对自身进行调整。其中一种变构调节物质是柠檬酸。对于变构效应物柠檬酸结合位点的研究表明，这个结合位点是来自于原核生物中的磷酸果糖激酶上的磷酸烯醇式丙酮酸/ADP结合位点氨基酸残基参与了柠檬酸的结合，因此，在PFK的C-端和N-端都有所发现。氨基酸残基的变化是由基因的单点突变或者是化学修饰造成的。到目前为止，预案和微生物中的磷酸果糖激酶的结晶结构已经有两类被测出，一类是大肠杆菌，另一类是，但是，大多数哺乳动物的磷酸果糖激酶没有得到准确的结构，只有模式哺乳动物的磷酸果糖激酶结构被构造。从模式动物的柠檬酸结合位点研究中得到，这一位点位于N-端和中心区域之间，可能是在原有的酶上形成一个裂缝。但是，到目前为止，没有关于柠檬酸的抑制作用的确切作用机理。柠檬酸是三羧酸循环中的起始物，是衔接糖酵解和三羧酸循环的中间物质。在细菌中柠檬酸的抑制作用就没有，但是在脊椎动物中有较强的抑制作用，在昆虫中的抑制作用较弱。在最近的研究中表明有证据显示，单一的氨基酸残基在柠檬酸结合位点可决定酶在三羧酸循环中的敏感性。在多细胞动物的演化中表明，选择性的突变导致柠檬酸对磷酸果糖激酶的强烈抑制作用，这也说明了对糖酵解严格的控制对于哺乳动物的重要性。四肌肉中乳酸对于磷酸果糖激酶的影响磷酸果糖激酶是糖酵解中的关键酶蛋白，它的构象受到多种物质的调节。包括一个二聚体结构和一个四聚体结构。在肌肉中，磷酸果糖激酶有不同的低聚物形态，包括四聚体形态和二聚体形态。在较高的浓度下，它可以聚集为更大的低聚物形式。肌肉中的磷酸果糖激酶的调控受到多种因素的调节，如pH，柠檬酸，ADP等。自身可以调节自己的低聚物的状态，柠檬酸稳定磷酸果糖激酶的二聚体形态，这一形态与抑制作用有关。乳酸的聚集与磷酸果糖激酶的的抑制效应相对应。乳酸的作用表明，即使是在细胞内部的pH值不发生改变的情况下，也可以发生抑制作用。磷酸果糖激酶在种子内的活动可以解释糖酵解的活动，以及休眠种子在休眠期的情况。对休眠期种子的糖酵解活动的研究，进一步了解磷酸果糖激酶和磷酸果糖的作用和功能。此外，磷酸果糖- 1 -激酶缺陷导致骨骼肌糖原累积和心脏病。这是一种罕见的遗传性疾病第七型糖原累积病（GSDVII）。五磷酸果糖激酶与糖尿病治疗糖尿病代谢紊乱主要是由于胰岛素生物活性绝对或相对不足引起的，型糖尿病的改变尤为显著。型糖尿病，胰岛素分泌不足与胰岛素抵抗是其两个基本发病原因，而前者常继发于后者。糖代谢葡萄糖进入细胞在胞内磷酸化减少，糖酵解减弱，磷酸戊糖通路减弱，三羧酸循环减弱,能量供给明显减少，糖原合成减少、分解增多。总而言之，葡萄糖在肝、肌肉和脂肪组织的利用减少，肝糖输出增多，从而发生高血糖。H2O2可增强白细胞的细胞内杀菌活性，细胞内H2O2。主要由糖酵解产生的还原型辅酶(NADP)与氧分子作用生成。糖尿病病人白细胞磷酸果糖激酶活性降低，糖酵解明显降低，H2O2生成减少，使白细胞内杀菌活性减弱。血糖控制不良的糖尿病病人细胞内杀菌能力明显低于血糖控制良好者，提示细胞内杀菌能力与血糖控制程度相关。血糖控制不良的糖尿病病人由于体内蛋白质合成减少，分解加快，体内蛋白质进行性消耗，使免疫球蛋白、补体等生成减少，淋巴细胞转化明显降低，T细胞、B细胞和抗体数量减少。当病人合并糖尿病酮症酶中毒时，酮体可降低乳酸的杀菌能力，从而削弱了血液杀菌力和细胞介导的免疫反应。明尼苏达州大学（the University of Minnesota）Lange实验室的研究人员最近发现通过增加糖代谢中一种关键调控因子的浓度可以改善肝脏中的糖循环。这一发现降为糖尿病以及肥胖症提供了一种新颖的治疗方案。研究结果刊登在8月16号Cell Metabiolism上。肝脏是糖代谢的主要场所，特别是其中的糖异生过程（由非糖物质合成葡萄糖的过程，是糖酵解的相反过程）。糖尿病人（包括I型和II型）的肝脏中正是由于葡萄糖和脂肪储存过多，无法运送出去给细胞利用而导致代谢紊乱。明尼苏达州大学的研究人员针对这一方面，希望可以找到一种方法增加肝脏运送葡萄糖的能力。通过实验，他们发现了一种小的调控分子2,6-二磷酸果糖，这种中间代谢物是磷酸果糖激酶最强的别构激活剂，凭借对它的调节，可以控制体内糖代谢。Lange实验室博士后吴朝东以及其它科研人员利用小鼠模型增加了2,6-二磷酸果糖的浓度后发现小鼠的血糖降低了。吴朝东也同时注意到在肥胖症小鼠细胞中通过改变2,6-二磷酸果糖的浓度还引起了其它变化，比如当2,6-二磷酸果糖的浓度增加时，食物摄入和整体的新陈代谢都发生了变化。这就像人体一样：食物摄入降低，能量消耗增加时，体重就会减轻。六磷酸果糖激酶在糖酵解中的地位糖酵解的第一步是葡萄糖磷酸化为6-磷酸葡萄糖。哺乳类动物体内已发现有4种己糖激酶同工酶，分别称为至型。6-磷酸葡萄糖可反馈抑制己糖激酶，己糖激酶对葡萄糖的亲和力很高。它的特点是：对葡萄糖的亲和力很低；受激素调控。肝葡萄糖激酶不受其6-磷酸葡萄糖抑制。磷酸化过程消耗一分子ATP，后面的过程证明，这是回报很丰厚的投资。细胞膜对葡萄糖通透，但对磷酸化产物6-磷酸葡萄糖不通透，后者在细胞内积聚并继续反应，将反应平衡向有利于葡萄糖吸收的那一面推移。之后6-磷酸葡萄糖会在磷酸己糖异构酶的催化下生成6-磷酸果糖（在此果糖也可通过磷酸化进入糖酵解途径）。接着6-磷酸果糖会在磷酸果糖激酶的作用下被一分子ATP磷酸化生成1,6-二磷酸果糖，ATP则变为ADP。这里的能量消耗是值得的：首先此步反应使得糖酵解不可逆地继续进行下去，另外，两个磷酸基团可以进一步在醛缩酶的参与下分解为磷酸二羟丙酮和3-磷酸甘油醛。磷酸二羟丙酮会在磷酸丙糖异构酶帮助下转化为3-磷酸甘油醛。两分子3-磷酸甘油醛会被NAD+和 3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)氧化生成1,3-二磷酸甘油酸(1,3-BPG)。下一步反应，1,3-二磷酸甘油酸转变为3-磷酸甘油酸。此反应由磷酸甘油酸激酶催化，2个1,3-二磷酸甘油酸各将1个高能磷酸键转移到ADP上，生成两分子ATP。在此，糖酵解能量盈亏平衡。两分子ATP消耗了又重新生成。ATP的合成需要ADP作原料。如果细胞内ATP多（ADP则会少），反应会在此步暂停，直到有足够的ADP。这种反馈调节和重要，因为ATP就是不被使用，也会很快分解。反馈调节避免生产过量的ATP，节省了能量。磷酸甘油酸变位酶(phosphoglycerate mutase)推动3-磷酸甘油酸生成2-磷酸甘油酸，2-磷酸甘油酸在烯醇化酶(enolase)的催化下生成磷酸烯醇式丙酮酸 (phosphoenolpyruvate, PEP)和水。磷酸烯醇式丙酮酸含有高能磷酸键，是一种高能化合物。最后，在丙酮酸激酶的作用下磷酸烯醇式丙酮酸转变成丙酮酸， 并通过底物水平磷酸化生成ATP，此步反应也受ADP调节。值得一提的是，生成1，6-二磷酸果糖后的大部分反应都是向能量升高的方向进行的，没有酶（磷酸果糖激酶(PFK),磷酸甘油酸激酶 (PGK)）的催化 ，是不会自发进行的。而糖酵解的逆过程-糖异生（从甘油等非糖物质生成葡萄糖）则容易进行，此过程用到大部分在糖酵解里面出现过的酶，除了提到的两位“车夫”外，它们只出现在糖酵解中。在糖异生这两步逆反应会放出大量的热，分别为-14 及 -24 kJ/mol。七小结磷酸果糖激酶的研究在临床医学上的应用主要在脑科学，糖尿病的治疗等方面。对于，对磷酸果糖激酶的研究，在动物、植物、微生物方面都有巨大的作用。对于磷酸果糖激酶的信号传导机制，作用机理都将会是研究的热点。参考文献1. 宋惠萍 磷酸果糖激酶的进化 国外医学分子生物学分册第7卷第5期19852. 吴敏贤, 查静娟, 施教耐. 玉米叶片依赖焦磷酸的磷酸果糖激酶两种分子型动力学特性的研究J. 植物生理学报, 1986(4):38-50.3. 陶萍, 吴耀生. 6-磷酸果糖激酶-2/果糖双磷酸酶-2是一种重要的代谢信号酶J. 生命的化学, 2006, 26(2):110-113.4. 田克立, 林建群, 刘相梅,等. 大肠杆菌磷酸果糖激酶基因在极端嗜酸性氧化硫硫杆菌中的表达J. 微生物学报, 2003, 43(5):592-598.5. 管玉霞, 张洪秀, 邢莉丽. 反相高效液相色谱法测