外源基因表达系统PPT课件.ppt

2020 3 20 1 第七章外源基因表达系统 2020 3 20 2 基因工程所用的宿主菌 皆经过人工改造原因是野生型细菌具有针对外源DNA的限制和修饰系统 会切割未经修饰的外源DNA 经过改造的宿主菌一般具备下列特点限制系统缺陷型 不切割外源DNA 重组缺陷型 避免外源DNA与宿主DNA的重组 转化亲和型 改变细胞壁的通透性 提高转化效率 2020 3 20 3 第一节大肠杆菌表达系统一 大肠杆菌表达体系的优点 外源基因可以高水平表达培养方便 价廉 可大规模生产生物学 遗传学背景清楚安全性好寄主菌株及载体较多 2020 3 20 4 大肠杆菌 2020 3 20 5 二 大肠杆菌的表达条件 克隆的真核基因必须连续 无内含子序列 大肠杆菌不能识别真核启动子 外源基因须置于原核启动子的控制之下 常用的启动子有Lac trp tac T7 PL等 强启动子外源蛋白质的表达占菌体总蛋白质的10 30 2020 3 20 6 启动子有关知识 大肠杆菌的启动子是控制外源基因转录的重要元件 基因表达程度与启动子的强弱密切相关 启动子的强弱主要取决于启动子本身的序列 尤其是 10区 TATAA 和 35区 TTGACA 的组成 在真核基因中发现了类似Pribnow框的共同序列 即位于 25 30bp处的TATAAAAG 也称TATA框 TATAbox 2020 3 20 7 常用的大肠杆菌启动子 Plac来源于乳糖操纵子Ptrp来源于色氨酸操纵子PL来源于 噬菌体早期操纵子PrecA来源于recA基因 2020 3 20 8 启动子的可控性 目前使用的大肠杆菌启动子 一般含有与阻遏蛋白特异性结合的序列 因此由这些启动子介导的外源基因在大肠杆菌细胞内通常是痕量表达的 例如在不含乳糖的培养基内 Plac启动子处于阻遏状态 外源基因极少表达 2020 3 20 9 当重组大肠杆菌生长到某一阶段 向培养物中加入乳糖或IPTG 异丙基硫代半乳糖苷isopropylthiogalactoside IPTG 它们特异性的与阻遏蛋白结合 使之从操纵子上脱落下来 启动子打开并启动外源基因转录 化学诱导 2020 3 20 10 温度诱导 PL启动子将工程菌先置于300 进行培养 在此温度范围内 由大肠杆菌合成的CI857阻遏蛋白与PL的操纵子区域结合 关闭外源基因的转录 当工程菌培养到合适的生长阶段 一般为对数生长中期 时 迅速将培养温度提高到420 此时CI857失活 从操纵子上脱落下来 PL启动子遂启动外源基因转录 2020 3 20 11 化学诱导与温度诱导在实验室规模比较容易做到 发酵罐1 5升 但在工业化生产时 发酵罐数十升 数百升乃至数千升 生产成本很高 2020 3 20 12 为解决此问题 可对工程菌进行改造 例如 采用双质粒表达系统将CI857阻遏蛋白编码基因置于Ptrp启动子之下 克隆在一个低表达质粒上 从而保证阻遏蛋白表达较低 第二个重组质粒则含有PL启动子控制的目的基因 当培养基中缺少色氨酸时 Ptrp打开 CI857阻遏蛋白生成 由PL介导的目的基因不表达 相反 当色氨酸大量存在时 Ptrp启动子关闭 CI阻遏蛋白不再生成 PL开放 2020 3 20 13 此工程菌可用糖蜜和酪蛋白水解物组成的廉价培养基进行发酵 内含微量的色氨酸 欲使外源基因表达时 可加入富含色氨酸的胰蛋白胨进行诱导 2020 3 20 14 原核表达存在的问题翻译后的加工修饰真核细胞的某些蛋白质翻译合成后 还需要加工和修饰 如糖基化 但大肠杆菌细胞无此功能 细菌蛋白酶的存在细菌蛋白酶对外源蛋白质的切割 2020 3 20 15 真核基因在大肠杆菌细胞中表达的部位 1 表达产物存在的部位 细胞质 细胞周质 分泌到细胞外 细胞质中表达 包涵体 inclusionbody 细胞质中不溶性的蛋白质聚集形成的颗粒 2020 3 20 16 优点 形成包涵体 易于纯化分离 抵抗细菌蛋白酶的水解 对寄主无毒害蛋白质产量高表达载体构建比较简单 2020 3 20 17 缺点 形成包涵体的外源蛋白质 一般没有生物活性 恢复生物学活性的过程 有时非常困难 活性蛋白质的终产量低 细胞质还原的环境不利于形成二硫键N 末端存在甲硫氨酸 蛋白质真实性受影响蛋白质种类多 纯化工作量比较大 2020 3 20 18 周质中表达周质 periplasm 大肠杆菌一类格兰氏阴性细菌中 位于内膜和外膜之间的细胞结构表达于细胞质中的蛋白 借助信号肽穿过细胞内膜到达周质 2020 3 20 19 优点 蛋白种类少 易纯化酶解程度低促进二硫键的形成和蛋白质的折叠蛋白质N 端真实性缺点 转运的效率不稳定 2020 3 20 20 表达产物分泌到细胞外诱导大肠杆菌细胞分泌外源蛋白质利用信号肽 融合蛋白配体 透化剂 蛋白质合成后需要经过复杂机制 定向输送到最终发挥生物功能的细胞靶部位 这一过程称为蛋白质的靶向输送 蛋白质合成后的靶向输送 蛋白质的靶向输送 proteintargeting 所有靶向输送的蛋白质结构中存在分选信号 主要为N末端特异氨基酸序列 可引导蛋白质转移到细胞的适当靶部位 这一序列称为信号序列 信号序列 signalsequence 常见的信号序列由10 40个氨基酸残基组成 N端为带正电荷的氨基酸残基 中间为疏水的核心区 而C端由小分子氨基酸残基组成 加工区 可被信号肽酶识别并裂解 信号假说 分泌型蛋白质的定向输送 就是靠信号肽与胞浆中的信号肽识别粒子 SRP 识别并特异结合 然后再通过SRP与膜上的对接蛋白 DP 即SRP受体 结合后 开放膜蛋白通道 分泌性蛋白穿过膜 膜外侧面信号肽酶切断信号肽加工区 信号肽的一级结构 2020 3 20 26 优点 酶解作用低纯化方便增进蛋白折叠N 端的结构真实 2020 3 20 27 分泌表达形式的缺点 相对其它生物细胞而言 大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全 外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达 少数外源基因即便能分泌表达 但其表达率通常要比包涵体方式低很多 2020 3 20 28 短小芽孢杆菌表达蛋白质 例1 表达白细胞介素 2 表达产物无需复性处理 即具有生物活性 产率达50mg L 例2 表达人表皮生长因子 EGF 产率达1g L以上 澳大利亚盛产羊毛 每年需要大批的剪羊毛的技工 由于EGF可引起羊毛从根部自行脱落 故每只羊注射5mgEGF 在1月后可用手直接抓下羊毛 2020 3 20 29 利用梭菌属嗜热菌株由纤维素生产乙醇 纤维素是由葡萄糖单体以 1 4 糖苷键连接的多糖 利用梭菌属嗜热菌株可由纤维素直接发酵生产乙醇 利用基因工程技术改造菌株 增加乙醇的产率 降低副产物 如乙酸 丁酸等 2020 3 20 30 第二节酵母菌表达体系 2020 3 20 31 酵母菌的种类 酵母菌 Yeast 有56个属500多个种组成 如果说大肠杆菌是最成熟的原核表达系统 则酵母菌是最成熟的真核表达系统 常用的有 酵母属 如酿酒酵母 毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母属 裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母 2020 3 20 32 一 啤酒酵母 啤酒酵母又名面包酵母 被称为真核生物中的 大肠杆菌 易于培养其单倍体核酸DNA容量为大肠杆菌基因组的3 5倍 2020 3 20 33 啤酒酵母特点 培养简单 经济 快捷适于有氧和无氧条件下的大规模培养单倍体酵母细胞含有15Mb的基因组 16条大小约200 2200Kb的线性染色体 培养室内空气可闻 2020 3 20 34 二 甲醇酵母表达体系 2020 3 20 35 1 甲醇酵母的生物学特点 甲醇酵母是一种甲基营养型酵母 在缺乏碳源如葡萄糖 甘油时 能利用甲醇作为唯一的碳源 生长温度28 30 C 如巴斯德毕赤酵母就是常用的表达系统 2020 3 20 36 2 甲醇酵母表达系统的优点 具有强有力的乙醇氧化酶基因 AOX1 启动子 可严格调控外源蛋白的表达作为真核表达系统 可对表达的蛋白进行翻译后的加工和修饰 从而表达出有生物活性的外源蛋白营养要求低 生长快 培养基廉价 便于工业化生产可高密度发酵培养 2020 3 20 37 2020 3 20 38 表达量高 数百mg L以上水平表达的蛋白既可存在于细胞 又可分泌到胞外 由于甲醇酵母自身分泌的蛋白 背景蛋白 非常少 十分有利于纯化 糖基化程度低 2020 3 20 39 多型汉逊酵母表达系统 已用于表达乙肝表面抗原 2020 3 20 40 3 应用举例 毕赤酵母牛溶菌酶 乙肝表面抗原 人肿瘤坏死因子 人表皮生长因子 人组织纤溶酶原活化剂 链激酶 破伤风毒素片段C 2020 3 20 41 乳酸克鲁维酵母牛凝乳酶 人白细胞介素1 半乳糖苷酶多型汉逊酵母乙肝表面抗原 半乳糖苷酶葡萄糖淀粉酶 2020 3 20 42 第三节昆虫细胞表达系统 昆虫属于动物界节肢动物门昆虫纲 其发育过程以变态而著称 昆虫是地球上分布最广 数量最多的动物 有上百万种 用于表达外源基因的多为家蚕系统 2020 3 20 43 昆虫表达系统 昆虫是高等真核生物 能进行翻译后加工和修饰 昆虫细胞常用于真核蛋白质的生产 其生长速度快 不需要CO2培养箱 易于悬浮培养 可用于大规模表达蛋白质 2020 3 20 44 家蚕表达系统 家蚕属于鳞翅目家蚕科 人类饲养家蚕已有5000余年历史 我国是家蚕业的发祥地 自古以来农桑并茂 丝绸之路名扬天下 我国的生丝产量占世界总产量的70 丝绸业的年产值达700亿元 2020 3 20 45 我国科学家于2003年率先完成家蚕基因组框架图 覆盖率和精确度分别达到95 54和99 95 是我国科学家向人类社会贡献的第三大基因组研究成果 2020 3 20 46 家蚕的特点是丝素蛋白的高效表达 蚕丝的主要成分是丝素蛋白 在家蚕的丝素蛋白合成期 每个细胞每秒合成数万个丝素分子 2020 3 20 47 杆状病毒载体 杆状病毒是含有包膜的双链DNA病毒 宿主为无脊椎动物 主要感染昆虫 包括鳞翅目 膜翅目 鞘翅目 毛翅目等 杆状病毒表达载体可分为两大类 1 表达单个外源基因2 表达多个外源基因 2020 3 20 48 杆状病毒载体的构建 以pUC质粒为基础构建 提供Amp抗性 多角体蛋白编码基因的启动子 多克隆位点位于该启动子的下游 家蚕丝心蛋白编码基因启动子 被认为是自然界最强的启动子 但由其介导的外源基因高效表达对宿主细胞的生理过程有干扰 2020 3 20 49 二 昆虫细胞宿主 常用的宿主为sf9和sf21 来源于草地夜蛾的卵巢细胞 2020 3 20 50 第四节哺乳类细胞表达系统 优点 哺乳动物细胞可加工修饰表达的蛋白质 包括二硫键的形成 糖基化 磷酸化 寡聚体的形成 蛋白酶的定点切割产生具有天然活性的蛋白质缺点 细胞生长缓慢 培养周期长 生产成本高 2 蛋白质切割 末端切割膜蛋白 分泌蛋白 在氨基端具有一段信号肽 信号肽必须切除多肽链才具有功能 脊椎动物前胰岛素原长105aa 首先切除氨基端的24aa 成为前体胰岛素再将中间的一段切除 留下两端有活性的部分 即21aa酸残基的A链和30aa的B链两条链由两个二硫键连接成有生物活性的胰岛素 51 3 蛋白质的化学修饰 简单的化学修饰 将乙酰基 甲基 磷酸基 羟基等小基团加到氨基酸侧链上 或者加到氨基端或羧基端不同蛋白质可以有完全相同的修饰相同的蛋白质可以有完全不同的修饰磷酸化在基因表达中具有重要的调控作用 52 复杂的修饰 糖基化 glycosylation 将不同的碳水化合物 糖类 加到多肽链上 53 人类的ABO血型 控制ABO血型的是一个复等位基因座位 编码负责将糖基加到红细胞膜上的糖蛋白分子上的酶 三个等位基因 编码三个不同的酶将N 乙酰 半乳糖胺 N acety galactosamine 加到糖蛋白上 A血型将半乳糖 galactose 加到糖蛋白上 B血型第三个基因编码的酶无功能 不能将任何糖加到糖蛋白上 O血型 2020 3 20 54 2020 3 20 55 常用的哺乳动物表达细胞 CHO细胞中国仓鼠卵巢上皮细胞 是一株缺乏二氢叶酸还原酶的营养缺陷突变株 表达量可达10mg L 可大规模培养 数千升 已表达的产物有组织纤溶酶原激活剂 tPA 凝血因子 红细胞生成素等 2020 3 20 56 COS细胞来源于非洲绿猴肾细胞系 CV 1 属于瞬时表达细胞 即由于转染质粒在宿主细胞中大量表达 导致细胞死亡 2020 3 20 57 从2000年以后 哺乳动物细胞表达系统更受重视 目前 美国418种在研药物中约70 是以哺乳动物细胞表达的 在FDA已批准上市的生物技术药物中 哺乳动物细胞表达的产品占70 以上 2020 3 20 58 一 用于哺乳动物细胞表达的载体 病毒载体 1 含有能够被真核细胞识别的有效启动子 2 在感染周期中能够持续复制 达到很高的拷贝数 3 控制自己复制的元件 4 有些载体可高效稳定地整合到寄主基因组上 5 外壳蛋白识别细胞受体 可将外源基因高效导入受体细胞 2020 3 20 59 1 SV40病毒载体 SV40 猿猴空泡病毒 Simianvacuolatingvirus40 SV40 环型双链DNA分子 含5243bp 2020 3 20 60 重组的病毒 质粒载体 含有完整的早期区段和复制起点的病毒 质粒载体 病毒的早期区段和复制起点 大肠杆菌的质粒分子重组而成 例如 p C10 早期区段和复制起点 多瘤病毒 质粒pBR322这种载体既可在大肠杆菌中复制 也可在哺乳动物细胞中复制 称之为穿梭载体 2020 3 20 61 2 反转录病毒载体宿主范围广 感染动物或人的细胞 具有强启动子不引起宿主细胞的死亡 可以维持许多代 2020 3 20 62 第四节外源基因导入宿主细胞的物理化学方法参见教材第六章P121页 2020 3 20 63 1 磷酸钙沉淀法转染技术 1973年F L Graham等人建立通过形成一种DNA 磷酸钙沉淀物 使之黏附到培养的哺乳动物单层细胞表面 就会迅速地被细胞捕获能将任何外源基因有效地导入培养的哺乳动物细胞 2020 3 20 64 DNA CaCl2混匀 Hepes 磷酸盐溶液中 DNA 磷酸钙沉淀 沉淀吸附到细胞上共同孵育 换培养液 筛选 10 的细胞转入了外源DNA 搅拌中逐滴加入到 2020 3 20 65 2 DEAE 葡聚糖转染技术 DEAE 葡聚糖是一种高分子量的多聚阳离子试剂 能促进哺乳动物细胞捕获外源的DNADEAE