做Western blot仪器Odyssey.ppt

Odyssey红外激光成像系统 蛋白研究的多功能平台 WesternBlot常见检测方法 化学显色法如DAB显色放射自显影法如同位素化学发光法如ECL化学荧光法如IRdye680 IRdye780 化学显色法操作简便 无需暗房和显影设备 显色直观 但灵敏度较低 国外已不常见 化学发光法 ECL 比化学显色法灵敏度高 可达pg水平 但由于是酶促反应 不同曝光时间得到的信号与样品量不成线性关系 不能做准确定量 荧光法采用荧光检测原理 操作简单 荧光信号强弱直接反映目的蛋白量 可进行精确定量 还可以根据荧光染料的不同 用不同的荧光二抗可以在同一张膜上同时检测两种蛋白质 不同检测方法特点 ECL常见问题 暗房操作麻烦 曝光时间难以控制 无法准确定量背景高 高浓度蛋白易出现 吹泡 现象检测两种蛋白时 需要Stripping和Re probe 操作复杂胶片上无法直接观察到Marker 解决方案 Odyssey 双色红外荧光成像系统荧光红外双色荧光 准确定量 线性范围宽广红外 背景低 信噪比高双色 同时检测 同时输出 OdysseyVSECL流程 荧光直接检测 INFRAREDLASERDIODE INFRAREDAPDDETECTOR ON SCREENDisplay 信号持久 不需要底物 不需要底片 暗室 荧光 准确定量 TIME TIME CHEMILUMINESCENCE动态信号 信号随时间变化信号不与目标蛋白浓度成比例关系 ODYSSEY静态信号 信号不随时间变化信号和目标蛋白浓度成比例关系 Highconcentration signal Mediumconcentration signal Lowconcentration signal 0 0 0 0 INTENSITY 红外荧光VS化学发光定量线性范围 Odyssey能检测到0 6pg的蛋白 灵敏度高 Odyssey成像呈现一个很好的线性 定量准确 ECL ODYSSEY Odyssey系统定量的线性相关性 倍比稀释的IRDye800 标记的抗体 R2从1 5ngto0 8pg是0 99996 极佳的线性相关性 1 5ng 0 8pg 极佳的线性相关性增加了定量的准确性 Dilutionsoftransferrindetectedwithrabbitanti TfprimaryandAlexaFluor680goatanti rabbitsecondary Sensitivityis250 foldhigherthanreportedfortheBio RadMolecularImagerFXwithfluorescentantibodies 100 foldhigherthanECL BioTechniques29 636 642 红外荧光VS化学发光 红外荧光VS化学发光成像效果 Odyssey 曝光 秒 曝光 分钟 曝光 分钟 曝光 分钟 红外 荧光DEMO 实验步骤 Odyssey 膜 一抗孵育 荧光标记抗体孵育 Odyssey扫描成像ECL 膜 一抗孵育 酶联二抗孵育 底物显色 UVP扫描成像 实验目的检测培养细胞转染外源基因的表达状况 MarkerS1S2S3S4 MarkerS1S2S3S4 Odyssey结果 ECL结果 信号强度5120104 信号强度302623019 Odyssey软件分析结果 结论 Odyssey和ECL的相对灵敏度相差不大Odyssey红外激光成像系统具有更好的线性关系和更精确的定量结果Odyssey扫描图能同时看到Marker和目标蛋白 ECL看不到Marker 10 4 2 1稀释 红外技术优点 低背景 红外荧光vs可见荧光膜背景信号 背景更低 信噪比高 保证更好检测灵敏度定量线性范围更宽 可达4个数量级 定量更准确穿透力更强 活体成像的应用 红外荧光优点 Odyssey 双色同时检测 800nm 700nm Overlay 两套独立激发检测系统700通道 680nm激发720nm检测800通道 780nm激发820nm检测 靶蛋白 靶蛋白核酸 结合蛋白Marker 总蛋白参比蛋白 靶蛋白总蛋白 修饰化蛋白 Odyssey双色应用 Noneedtostrip Noneedtore probe 双通道同时检测 TargetproteinAnti rabbit800channel NormalizertargetAnti mouse700channel Two colordetectionrequiresprimaryantibodiesfromdifferenthosts 双色 ERK蛋白的磷酸化 Anti EGFRandanti phospho EGFRantibodyspecificityinA431cells Singlecolorimages BandC canbeoverlaid A toshowbothtotalproteinandphosphorylatedprotein Themobilityshiftcausedbyphosphorylationisvisible A asindicatedbytheredbandsabovetheyellowbands yellowindicatesoverlappingredandgreensignals 双色 EMSA BindingofT7RNAPtotwoDNAfragmentscontainingtheT7promotersequence labeledwitheitherIRDye700 red orIRDye800 green 700and800Overlay 700nmChannel 800nmChannel DNA ProteinComplex UnboundDNAIRDye800 UnboundDNAIRDye700 Odyssey双色检测的优越性 双色输出 两个目标基因同时检测 减少了工作量 而且杂交条件均等 便于两个数据的对比杂交结果对比输出 结论更加直观 一目了然可进行准确的量化分析 In CellWesternAssay TheOdysseyIn CellWestern ICW Assayisahigh throughputapproachtosimultaneouslydetectandquantifytwoseparateproteinsdirectlywithincells In CellWesternAssay 细胞培养Culturecellstoconfluencyin96 wellor384 wellplates 处理细胞Treatcells inhibitor stimulator etc 固定细胞Fixcells 3 7 formaldehyde methanolorPrefer 透化细胞Permeabilizecells 0 1 Triton X100 Odyssey系统扫描ScanplatedirectlyandanalyzeontheLI CORInfraredImagingSystems In CellWestern工作流程 MembraneWesternsvsICW EGF对ERK磷酸化水平的调控 700nm TotalERK 800nm Phospho ERK CompositeImageOverlay EGFConcentration A431cellsstimulatedwithserialdilutionsofEGFtooptimizeactivationofERK1 2 Phospho ERKsignalwasnormalizedusingtotalERKsignal EGF抑制剂对ERK磷酸化水平的影响 QuantitativeandsimultaneousmeasurementsoftotalERKandphosphorylationofERKinresponsetoEGFinthepresenceofEGFRinhibitor In CellWestern软件模块 在用客户提供的结果 图片由上海中医药大学复杂系统研究中心DrLiu提供 OdysseyICW的优点 高速与普通膜杂交相比 通量提高30倍ICW软件提供便捷的计算和分析准确红外检测提供最准确的量化结果 避免在细胞裂解等步骤中蛋白的损失 操作简单操作步骤简单 ICW相关试剂 目前可以提供4种试剂盒 其他经ICW验证的抗体以及kit 应用文献一 P P P P EGFR Ras Raf Mek ERK JAK STAT1 STAT3 Grb2 SOS EGF EGFRSignaling RAS RAF Mek ERK信号通路 KSR1 左图 TheeffectofKSR1phosphorylationonMEK1 2andRSK1activation 上图 MutationofKSR1phosphorylationsitesenhancesthedurationofERKactivation 应用文献二 蛋白质芯片扫描 CSTPathScanRTKSignalingantibodyarraykit 7949 kit包括 所有的辅助产品和试剂R D4种适合Licor检测试剂盒 小动物活体成像 双色 小动物活体成像 附件 软件功能 仪器软件AdministrationDiagnostics应用软件图象控制背景扣除条带发现和定位定量ICW 结果计算 includingnormalization 小动物活体分析 Odyssey系统发表文献统计 PaperList Nagashima K etal GeneticandpharmacologicalinhibitionofPDK1incancercellscharacterizationofaselectiveallosterickinaseinhibitorJ Biol Chem286 6433 2011 Sneeringer C J etal Coordinatedactivitiesofwild typeplusmutantEZH2drivetumor associatedhypertrimethylationoflysine27onhistoneH3 H3K27 inhumanB celllymphomasPNAS107 20980 2010 Cittelly D M etal OncogenicHER2D16suppressesmiR 15a 16andderegulatesBCL 2topromoteendocrineresistanceofbreasttumorsCarcinogenesis31 2049 2010 Pan Y etal Sprouty2 modulatedKrassignalingrescuesShp2deficiencyduringlensandlacrimalgladdevelopment Development137 1085 1093 2010 Markovic Detal Intracellularmechanismsregulatingcorticotropin releasinghormonereceptor 2betaendocytosisandinteractionwithextracellularlyregulatedkinase1 2andp38mitogen activatedproteinkinasesignalingcascades MolEndocrinol 22 3 689 706 2008 总结 准确定量 提供更完善的数据 提升文章档次成像效果好 背景低 条带清晰 没有吹泡现象双色检