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一，分组实验对象：A549细胞干预措施：含有0、5000ug/ml茶氨酸的细胞培养液分组：8个组别，即对照组， 5000ug/ml茶氨酸培养15min、30min、1h、 2h 6h、12h、24h组。二，实验试剂5X电泳缓冲液； tris 15.1g, glycine 94g, SDS 5.0g,加入800ml蒸馏水，搅拌溶解。加蒸馏水将溶液定容至1L后，室温保存。用的时候稀释成1*的就可以了。10*TBS缓冲液 ； tris 24.2g, NaCl 80g 。加蒸馏水将溶液定容至1L后，调PH7.6，室温保存。用的时候稀释成1*的就可以了。5X转膜缓冲液配制：Gly 144g、Tris-base 30g、SDS 1.875g，加蒸馏水至1000ml，4保存。1X转膜缓冲液配制：200mL转膜缓冲液母液（5X）+200mL 甲醇600mL 蒸馏水封闭液配制：1*TBST 缓冲液 95ml脱脂奶粉5g, 4保存,一周内使用。5X加样缓冲液:1.0 mol/L Tris缓冲液1.25ml，甘油4ml，SDS 0.5g，巯基乙醇250ul，溴酚蓝25mg，H2O定容至5ml混匀备用。按1:4比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮10min混匀后再上样1.0 mol/L Tris缓冲液:Tris 12.114g，H2O定容至100ml. PH 6.81.5 mol/L Tris缓冲液:Tris 18.17g，H2O定容至100ml. PH8.810% sds :Sds 10g H2O定容至100ml.10% AP :AP0.1g , H2O定容至1ml.10%下层胶 :H2O 5.9ml30%丙烯酰胺 5ml1.5 mol/L Tris缓冲液 3.8ml10% SDS 150ul10% AP 150ul TEMED 6ul5%上层胶 :H2O 4ml30%丙烯酰胺 1ml1.5 mol/L Tris缓冲液 0.75ml10% SDS 60ul10% AP 60ul TEMED 6ul三，实验操作过程1 蛋白样品制备 1、 倒掉培养液，向培养皿中加入裂解液，通常6孔板150-200ul/孔，12孔板50-60ul/孔，冰上放置，摇床20min 2、 用勺子刮下细胞，并吸出液体至1.5ml离心管中（注意冰上操作） 3、 于4下12000rpm离心5min。 4、 将离心后的上清分装转移倒1.5ml的离心管中放于-80保存。2 蛋白含量的测定 1. 取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(30mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶 液。配制后可立即使用，也可以-20长期保存。2. 取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。例如取20l 25mg/ml蛋白标准，加入980l稀 释液即可配制成0.5mg/ml蛋白标准。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简 便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。稀释后的0.5mg/ml蛋白标准也可以-20长期保存。3. 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。例如5ml BCA试剂A加100lBCA试剂B，混匀，配制成5.1ml BCA工作液。 BCA工作液室温24小时内稳定。4. 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20l加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20l。5. 加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20l。6. 各孔加入200l BCA工作液,37放置20-30分钟。 注:也可以室温放置2小时，或60放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，颜色会随着时间的延长不断加 深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或适当延长孵育时间。7. 测定A562，540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度3 SDSPAGE电泳 1、清洗玻璃板，玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。 2、 灌胶：配10下层胶（15ml，两块胶，每块胶在6.5 ml左右），加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。 灌胶后用水压平，静置45min 3、 胶凝后，弃去水，用水冲洗2次，并用吸水纸将水吸干。 4、 等待胶凝期间可计算含50-100ug蛋白的溶液体积即为上样量5、 配5的上层胶（6ml，两块胶）,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中，静置45min6、 将玻璃夹取出，在流水中冲洗，洗去正反面余胶，在水流中拔掉梳子，放入电泳箱。7、上样 Marker 6l 样本 20-30l通入电源，电压80V，电流300mA，功率50W，时间1.5hour。(电泳30分钟后可调节电压到120V)电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。4 转膜 1、配制转膜液2、事先将PDVF膜放在甲醇溶液中激活，同时将4X2层滤纸放入转膜液中，尽量压出其中气体。3、夹子黑的一面：海绵-2张滤纸-胶-PVDF膜-2张滤纸-海绵整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。4、将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，倒入转膜液。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用60V转移1h。转膜结束前配制封闭液（5%脱脂牛奶)及1X TBST缓冲液。5 免疫反应 1、封闭：将膜用移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2h。 2、 一抗 （1）封闭结束后，从封闭液中取出膜，1X TBST 10min X 3次;（2）将一抗用封闭液稀释至适当浓度，将膜蛋白面朝上