DNA的生物合成课件.ppt

DNA的生物合成 TheBiosynthesisofDNA 1 医药交流PPT 生物有机体的遗传特征以密码 code 的形式编码在DNA分子上 表现为特定的核苷酸排列顺序 遗传信息 在细胞分裂前通过DNA的复制 Replication 将遗传信息由亲代传递给子代 在后代个体发育中 遗传信息自DNA转录 Transcription 给RNA 并指导蛋白质合成 以执行各种生命功能 使后代表现出与亲代相似的遗传性状 这种遗传信息的传递方向 是从DNA到RNA再到蛋白质 即所谓的生物学 中心法则 80年代后在某些致癌RNA病毒中发现遗传信息也可存在于RNA分子中 由RNA通过逆转录 reversetranscription 的方式将遗传信息传递给DNA 2 医药交流PPT 1958年 弗朗西斯 克里克提出了 中心法则 他指出 遗传信息只能单向传递 即从DNA到RNA再到蛋白质 那时的 中心法则 只包括遗传信息从DNA传递给RNA 再从RNA传递给蛋白质的转录和翻译过程中 以及遗传信息从DNA传递给DNA的复制过程 其图解如下 DNA RNA 蛋白质 中心法则 3 医药交流PPT 它包含几个要点 1 DNA的功能是转录 它控制生命的遗传和生长 而它的基本结构不受生物活动和变化的影响 它是最保守的大分子 忠实地复制自身 抵制一切变革和进化 2 进化是起因于DNA偶然复制错误 3 众多的偶然复制错误 只有通过天择才能优胜劣汰 使生物不断地进化 4 医药交流PPT 那么遗传信息真的如克里克指出的只能单向传递吗 1970年生物学家梯明和巴尔蒂姆得出了与上述中心法则不同的结果 他们分别在肿瘤病毒中发现依赖RNA的DNA聚合酶 逆转录酶 在这种酶的催化下 RNA可以指导合成DNA 说明细胞中遗传信息可以从RNA传递给DNA 另外的一些病毒实验还表明 RNA是遗传信息的携带者 具有自我复制的能力 并同时作为mRNA 指导病毒蛋白质的生物合成 5 医药交流PPT 中心法则 上述结果促使克里克在1971年对中心法则作了进一步补充与完善 补充后的中心法则如下图所示 DNA中的碱基排列顺序决定了蛋白质中的氨基酸的顺序 决定了蛋白质的组成和结构 6 医药交流PPT 中心法则表示的是DNA和RNA以及蛋白质之间信息流的传递顺序 也叫做 中心命题 基本公式如下 DNARNA 蛋白质 中心法则 7 医药交流PPT 我们说DNA决定蛋白质 说的就是DNA决定蛋白质中的氨基酸排列顺序 氨基酸的排列顺序定下来 蛋白质的结构和功能也就确定了 所以说 DNA决定蛋白质 8 医药交流PPT 疯牛病 是一种侵犯牛中枢神经系统的慢性的致命性疾病 由一种非常规的病毒 朊病毒 Prion 引起的一种亚急性海绵状脑病 这类病还包括绵羊的痒病 人的克 雅氏病 Creutzfeldt JakobSyndrome CJD 又称早老痴呆症 以及最近发现的致死性家庭性失眠症等等 疯牛病的出现对一致的中心法则提出了挑战 因为在疯牛病的朊病毒是一类非正常的病毒 它不含有通常病毒所含有的核酸 而是一种不含核酸仅有蛋白质的蛋白感染因子 其主要成分是一种蛋白酶抗性蛋白 对蛋白酶具有抗性 可能的信息流是 蛋白质 DNA RNA 9 医药交流PPT 由DNA到RNA再到蛋白质的信息流是遗传信息流 而由蛋白质向DNA RNA的信息流向是反馈信息流 它们是两种性质不同的信息流 前者为了保持不变 是以拷贝 转录等方式进行的 而后者反馈新信息影响DNA局部的改变 是通过传导 催化 参与 调控等方式进行的 前者是一次性的拷贝和转录便可实现信息流动的目标 形成对象性的蛋白 而后者却要多代持久的反馈才能由渐变到突变实现进化的目标 不区分不同目标和方式的信息流 认为蛋白质只有像DNA一样能进行拷贝 才能出现逆向信息流 就会永远陷入中心法则的单向信息流而不得其解 10 医药交流PPT 既然生物三种大分子之间有双向信息交流 就应名副其实地用双向法则来替代中心法则 由DNA RNA 蛋白质的遗传信息流 是生物衍演后代保持物种稳定的转录信息流 是非常重要的一个流向 但由蛋白质 RNA DNA 以及由蛋白质 DNA RNA的信息流向 是促使生物不断开放 进化的反馈信息流 是另一必不可少的重要的信息流 正是由于这双向的信息流 才使生物不断衍演进化 从低级到高级 从简单到复杂 从单一到丰富 经过38亿年发展为今天这样无比生机勃勃 丰富多彩 协同有序的生命世界 11 医药交流PPT 第一节DNA的复制合成 第二节DNA的反转录作用 第三节DNA的损伤与修复 12 医药交流PPT 第一节DNA的复制 DNA作为遗传物质的基本特点就是在细胞分裂前进行准确地自我复制 self replication 使DNA的量成倍增加 这是细胞分裂的物质基础 1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型指出 DNA是由二条互补的脱氧核苷酸链组成 所以一条DNA链上的核苷酸排列顺序是由双螺旋DNA的复制另一条决定的 这就说明DNA的复制是由原来存在的分子为模板来合成新的链 13 医药交流PPT DNA的合成机理 14 医药交流PPT 15 医药交流PPT 复制的基本规律 1 半保留复制 2 在特定的部位开始原核一个 真核多个 3 单向或双向 4 从5 3 方向进行 5 半不连续复制 6 需要RNA作为引物 16 医药交流PPT 双螺旋DNA的复制 17 医药交流PPT 曾经有过多种关于DNA复制方式的学说 包括半保留复制 全保留复制以及分散复制 18 医药交流PPT 两条DNA母链用黄色 新合成的DNA链用蓝色表示 DNA分子复制时可能有三种途径 每一种都遵循碱基互补原则 1 保留复制途径认为复制完成后保留最初的母链并另外产生一条全新的完整DNA双链分子 2 分散复制途径认为复制后产生两条新老杂合的DNA双链分子 而且每条单链上新片段和老片段也是杂合在一起的 3 半保留复制途径认为复制后产生两条新老杂合的DNA双链分子 但是每条DNA双链分子中的单链 一条完全是新的 一条完全是老的 事实上 DNA的复制是半保留的 DNA母链中的两条单链各自作为新链合成的模板 按照碱基互补原则在母链上合成新链 合成的每条子链DNA双链分子中 各有一条新老单链 19 医药交流PPT 一 DNA的半保留复制 semiconservativereplication Watson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型时即推测 DNA在复制时首先两条链之间的氢键断裂 两条链分开 然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA链 这样新合成的子代DNA分子中一条链来自亲代DNA 另一条链是新合成的 这种复制方式为半保留复制 一 DNA复制的方式及一般过程 20 医药交流PPT 21 医药交流PPT 半保留复制的证明 22 医药交流PPT 1958年Meselson和Stahl利用氮标记技术在大肠杆菌中首次证实了DNA的半保留复制 DNA的半保留复制第一代分子含有一条亲代的链 用黑色素示 与另一条新合成的链 用白色表示 配对 在以后的连续复制过程中 原来亲代的两条链仍然保持完整 因此总有两个分子各具有一条原来亲代的链 23 医药交流PPT Inordertodeterminewhichofthesemodelswastrue thefollowingexperimentwasperformed TheoriginalDNAstrandwaslabelledwiththeheavyisotopeofnitrogen N 15 ThisDNAwasallowedtogothroughoneroundofreplicationwithN 14 andthenthemixturewascentrifugedsothattheheavierDNAwouldformabandlowerinthetube andtheintermediate oneN 15strandandoneN 14strand andlightDNA allN 14 wouldappearasabandhigherinthetube Theexpectedresultsforeachmodelwere 24 医药交流PPT 25 医药交流PPT 半保留复制实验 26 医药交流PPT DNA双螺旋是由两条方向相反的单链组成 复制开始时 双链打开 形成一个复制叉 replicativefork 从打开的起点向一个方向形成 或一个复制泡 replicativebubble 从打开的起点向两个方向形成 两条单链分别做模板 各自合成一条新的DNA链 由于DNA一条链的走向是5 3 方向 另一条链的走向是3 5 方向 但生物体内DNA聚合酶只能催化DNA从5 3 的方向合成 那么 两条方向不同的链怎样才能做模板呢 二 DNA复制的一般过程 27 医药交流PPT 28 医药交流PPT 29 医药交流PPT 原来 在以3 5 方向的母链为模板时 复制合成出一条5 3 方向的前导链 leadingstrand 前导链的前进方向与复制叉打开方向是一致的 因此前导链的合成是连续进行的 而另一条母链DNA是5 3 方向 它作为模板时 复制合成许多条5 3 方向的短链 叫做随从链 laggingstrand 随从链的前进方向是与复制叉的打开方向相反的 随从链只能先以片段的形式合成 这些片段就叫做岗崎片段 Okazakifragments 原核生物岗崎片段含有1000 2000核苷酸 真核生物一般100 200核苷酸 最后再将多个岗崎片段连接成一条完整的链 由于前导链的合成是连续进行的 而随从链的合成是不连续进行的 所以从总体上看DNA的复制是半不连续复制 30 医药交流PPT 31 医药交流PPT DNA的半不连续复制 32 医药交流PPT DNA复制是半保留复制 即经过一轮复制 在子代双链DNA分子中有一条链来自亲本的旧链 另一条链为新合成的 复制开始时 亲代DNA双链分子打开 分别作为模板 连续地合成一条前导链 不连续地合成一些片段 而后连成一条随从链 所以DNA复制是半不连续合成 DNA的复制是以DNA为模板 在DNA指导的DNA聚合酶催化下进行的DNA合成反应 合成原料为四种dNTP 合成反应的方向为5 3 反应中需要有RNA作为引物 合成产物DNA的序列与模板DNA的序列是互补的 细胞分裂时 通过DNA的复制作用 遗传信息从亲代DNA分子中传到子代DNA分子中 33 医药交流PPT DNA复制的全部过程可以人为地分成三个阶段 第一个阶段为DNA复制的起始阶段 这个阶段包括起始点 复制方向以及引发体的形成 第二阶段为DNA链的延长 包括前导链及随从链的形成和切除RNA引物后填补空缺及连接岗崎片段 第三阶段为DNA复制的终止阶段 34 医药交流PPT 1 模板和合成原料新合成DNA的特异性完全取决于模板DNA 三磷酸核苷酸 dATP dGTP dCTP dTTP 是合成原料 2 酶和蛋白质细胞内还有许多酶和蛋白质参与DNA的复制 螺旋酶 Helicase 可以和单链DNA结合 并且与ATP结合 利用ATP分解时产生的能量沿DNA链向前运动促使DNA双链打开 单链DNA结合蛋白 SSBP 能很快地和复制叉方向产生的单链区单链DNA结合 防止其重新配对形成双链DNA或被核酸酶降解 并使其呈伸展状态 有利于单链DNA作为模板 DNA拓扑异构酶 DNATopoisomerase 催化同一DNA分子不同超螺旋状态之间的转变 拓扑异构酶 的作用是使超螺旋DNA松弛化 拓扑异构酶 将负超螺旋引入DNA分子 负超螺旋的存在有利于DNA的双链分开 引物酶 Primase 和RNA聚合酶 RNAPolymerase 大肠杆菌中引物酶催化引物RNA分子的合成 在单链噬菌体M13DNA和质粒Co1E1DNA复制时 引物的合成是由RNA聚合酶催化的 参与 复制的物质 35 医药交流PPT 一 DNA复制的起始点很多实验都证明 复制是从DNA分子上的特定部位开始的 这一部位叫做复制起始点 originofreplication 常用ori或o表示 细胞中的DNA复制一经开始就会连续复制下去 直至完成细胞中全部基因组DNA的复制 DNA复制从起始点开始直到终点为止 每个这样的DNA单位称为复制子或复制单元 replicon 在原核细胞中 每个DNA分子只有一个复制起始点 因而只有一个复制子 而在真核生物中 DNA的复制是从许多起始点同时开始的 所以每个DNA分子上有许多个复制子 每个复制子长约50 200kb 二 DNA复制的起始阶段 36 医药交流PPT 37 医药交流PPT 1 定点开始双向复制 这是原核生物和真核生物DNA复制最主要的形式 从一个特定位点解链 沿着两个相反的方向各生长出两条链 形成一个复制泡 用电子显微镜可以观察到复制泡的存在 二 DNA复制的方向 38 医药交流PPT 39 医药交流PPT 2 定点开始单向复制 质粒colE1是个典型的例子 复制从一个起始点开始 以同一方向生长出两条链 形成一个复制叉 replicationfork 3 两点开始单向复制 腺病毒DNA的复制是从两个起点开始的 形成两个复制叉 各以一个单一方向复制出一条新链 DNA的半不连续复制和复制泡的形成 40 医药交流PPT DNA链生长方向的三种机制 41 医药交流PPT 1 解链酶 helicase DNA开始复制时首先在起始点处解开双链 反应是在一种解链酶 helicase 的催化下进行的 解链酶需要ATP分解供给能量 大肠杆菌中DnaB蛋白就有介链酶活性 与随从链的模板DNA结合 沿5 3 方向移动 还有一种叫做Rep蛋白和前导链的模板DNA结合沿3 5 方向移动 解链酶的作用就是打开DNA双链之间的氢键 三 DNA复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质 42 医药交流PPT 2 单链结合蛋白 singlestrandbindingproteins SSBP 它与解开的单链DNA结合 使其稳定不会再度螺旋化并且避免核酸内切酶对单链DNA的水解 保证了单链DNA做为模板时的伸展状态 SSBP可以重复利用 大肠杆菌DNA复制叉中复制过程简图 43 医药交流PPT 3 引发体的形成 DNA复制起始的关健步骤是前导链DNA的合成 一旦前导链DNA的聚合作用开始 随从链DNA的合成也随着开始 由于前导链的合成是连续进行的 所以它的起始相对简单 而随从链的合成是不连续的 所以引发阶段较复杂 1 引物酶 primase 它是一种特殊的RNA聚合酶 可催化短片段RNA的合成 这种短RNA片段一般十几至数十个核苷酸不等 它们在DNA复制起始处做为引物 2 引发体 primosome 高度解链的模板DNA与多种蛋白质因子形成的引发前体促进引物酶结合 共同形成引发体 引发体主要在DNA随从链上开始 它连续地与引物酶结合并解离 从而在不同部位引导引物酶催化合成RNA引物 在引物RNA的3 端接下去合成DNA片段 这是随从链不连续合成的开始 44 医药交流PPT DNA的复制实际上就是以DNA为模板在DNA聚合酶作用下 将游离的四种脱氧单核苷酸 dATP dGTP dCTP dTTP 简写为dNTP 聚合成DNA的过程 这是一个非常复杂的酶促反应 需要许多种酶和蛋白质参与 二 DNA复制的延长阶段以及参与的酶和蛋白质分子 45 医药交流PPT DNA复制时蛋白质的协同作用 当DNA复制时 各种蛋白质协同作用共同完成以下工作 1 在DNA解旋酶的作用下 两条母链部分解链 2 DNA单链结合蛋白结合到解开的DNA单链上 以防两条单链再次粘合 3 DNA聚合酶结合到DNA链上开始催化先导链和后随链的延伸 DNA聚合酶也可以检查自身工作的准确性 4 DNA聚合酶可以催化先导链连续地延伸 而在后随链中则是一段一段地合成冈崎片段 这时需要DNA引物酶重复地合成RNA引物来启动每个片段的延伸 5 最后 各个冈崎片段在DNA连接酶的作用下连接成完整的后随链 46 医药交流PPT 一 DNA的聚合反应和DNA聚合酶 1957年 Arthurkornberg首次在大肠杆菌中发现DNA聚合酶 DNApolymerase 简写DNApol 后来又相继发现了DNA聚合酶 和DNA聚合酶 1 DNA聚合酶 DNApol 是由一条多肽链组成 分子量为109KD 酶分子中含有一个Zn 是聚合活性必须的 大肠杆菌每个细胞中约有400个酶分子 每个酶分子每分钟在37 下能催化667个核苷酸参入到DNA链中 用枯草杆菌蛋白酶可将此酶水介成两个片段 大段分子量为76KD 通常称为klenow片段 小片段为34KD 大小片段具有不同的酶活性 47 医药交流PPT DNA聚合酶I的作用它具有5 3 聚合活性 3 5 外切和5 3 外切活性 1 DNA聚合酶的5 3 聚合活性 这是DNA聚合酶最主要的活性 按模板DNA上的核苷酸顺序 将互补的dNTP逐个加到引物RNA3 端 并促进dNTP的3 与5 端形成磷酸二酯键 酶的专一性表现为新进入的dNTP必须与模板DNA碱基配对时才有催化作用 48 医药交流PPT DNA聚合酶催化的DNA链延长 49 医药交流PPT 2 DNA聚合酶I的3 5 外切核酸酶活性 这种酶活性主要功能是从3 5 方向识别并切除DNA生长链末端与模板DNA不配对而游离的核苷酸 这种功能称为校对功能 这是保证其聚合作用的正确性不可缺少的 因此对于DNA复制中极高的保真性是至关重要的 3 DNA聚合酶I的5 3 外切核酸酶活性 这种酶活性是从DNA链的5 端向3 末端水解已配对的核苷酸 本质是切断磷酸二酯键 每次能切除10个核苷酸 因此 这种酶活性在DNA损伤的修复中可能起重要作用 对完成的DNA片段去除5 端的RNA引物也是必须的 DNApol 的5 3 聚合活性和5 3 外切酶活性协同作用 可以使DNA一条链上的切口从5 3 方向移动 这种反应叫做缺刻平移 nicktranslation 利用此反应可在体外对DNA片段进行放射性磷 32PdNTP 的标记制成探针 probe 进行核酸的分子杂交实验 是现代分子生物学的一项重要技术 50 医药交流PPT 缺刻平移标记DNA探针 51 医药交流PPT 2 DNA聚合酶 DNApol 此酶分子量为120KD 每个细胞约有100个酶分子 但活性只有DNApol 的5 它具有5 3 聚合活性和3 5 外切活性 而没有5 3 外切活性 它的作用可能与DNA损伤修复有关 3 DNA聚合酶 DNApol 这是在DNA复制过程中起主要作用的聚合酶 它是由一个多亚基组成的蛋白质分子 DNA聚合酶 全酶不是单独起作用 而是与引发体 介链酶等构成一个复制体 replisome 再在DNA的复制过程中发挥作用的 52 医药交流PPT 3 DNA聚合酶 DNApol 这是在DNA复制过程中起主要作用的聚合酶 它是由一个多亚基组成的蛋白质分子 DNA聚合酶 全酶不是单独起作用 而是与引发体 介链酶等构成一个复制体 replisome 再在DNA的复制过程中发挥作用的 53 医药交流PPT 54 医药交流PPT 真核生物DNA聚合酶真核生物DNA聚合酶有 及 它们的基本特性相似于大肠杆菌DNA聚合酶 其主要活性是催化dNTP的5 3 聚合活性 真核细胞在DNA复制中起主要作用的是DNApol 主要负责染色体DNA的复制 55 医药交流PPT 二 与超螺旋松驰有关的酶 DNA复制从起始点开始向一个方向复制时 局部的DNA双链必须打开 主要靠解链酶的作用 打开后的单链还要单链结合蛋白与其结合 在复制叉向前移动时造成其前方DNA分子所产生的正超螺旋 必须由拓扑异构酶来解决 拓扑异构酶 topoisomerase 是一类改变DNA拓扑性质的酶 在体外可催化DNA的各种拓扑异构化反应 而在生物体内它们可能参与了DNA的复制与转录 在DNA复制时 复制叉行进的前方DNA分子部分产生有正超螺旋 拓扑酶可松驰超螺旋 有利于复制叉的前进及DNA的合成 DNA复制完成后 拓扑酶又可将DNA分子引入超螺旋 使DNA缠绕 折叠 压缩以形成染色质 DNA拓扑异构酶有 型和 型 它们广泛存在于原核生物及真核生物中 56 医药交流PPT 大肠杆菌和真核生物中的拓扑异构酶 类型作用对超螺旋的作用 型拓扑异构酶大肠杆菌切开一股DNA链松驰负超螺旋真核生物切开一股DNA链松驰正 负超螺旋 型拓扑异构酶大肠杆菌切开二股DNA链构驰正超螺旋 依赖ATP引入负超螺旋 解环连等真核生物切开二股DNA链松驰正超旋 依赖ATP但不能引入负超螺旋 57 医药交流PPT 拓扑异构酶 Topo 的主要作用是将环状双链DNA的一条链切开一个口 切口处链的末端绕螺旋轴按照松驰超螺旋的方向转动 然后再将切口封起来 这就使DNA复制叉移动时所引起的前方DNA正超螺旋得到缓解 利于DNA复制叉继续向前打开 此外 拓扑异构酶 对环状单链DNA还有打结或解结作用 对环状双链DNA的环连或解连以及使环状单链DNA形成环状双链DNA都有作用 58 医药交流PPT 59 医药交流PPT 拓扑酶 及 的作用特点 a 大肠杆菌拓扑酶 催化的4种拓扑异构化作用 b 拓扑酶 的作用 60 医药交流PPT 拓扑异构酶 Topo 是在大肠杆菌中发现的 曾被称为旋转酶 gyrase 它们作用特点是切开环状双链DNA的两条链 分子中的部分经切口穿过而旋转 然后封闭切口 Topo 还可使DNA分子从超螺旋状态转变为松驰状态 此反应不需要ATP参与 DNA复制完成后 Topo 在ATP参与下 DNA分子从松驰状态转变为负超螺旋 此外 Topo 催化的拓扑异构化反应还有环连或解环连 及打结或解结 61 医药交流PPT DNA在复制过程中 合成出的前导链为一条连续的长链 随从链则是由合成出许多相邻的片段 在连接酶的催化下 连接成为一条长链 连接作用是在连接酶催化下进行的 连接酶 ligase 的作用是催化相邻的DNA片段以3 5 磷酸二酯键相连接 连接反应中的能量来自ATP 或NAD 连接酶先与ATP作用 以共价键相连生成E MP中间体 中间体即与一个DNA片段的5 磷酸相连接形成E AMP 5 DNA 然后再与另一个DNA片段的3 OHH末端作用 E和AMP脱下 两个DNA片段以3 5 磷酸二酯键相连接 随从链的各个DNA片段就是这样连接成一条DNA长链 四 DNA复制的终止阶段 62 医药交流PPT 连接酶的催化反应 63 医药交流PPT 最近的实验表明 在DNA上存在着复制终止位点 DNA复制可在复制终止位点处终止 不一定等全部DNA合成完毕 DNA复制的忠实性较高 是由于原核细胞的DNApol 及真核生物DNApol 及 均有3 5 外切酶活性 可以校正复制中出现的错误碱基 64 医药交流PPT DNA复制完成后 靠拓扑酶将DNA分子引入超螺旋结构 65 医药交流PPT 1 参与 复制的物质三磷酸核苷酸 dATP dGTP dCTP dTTP 通称dNTP 是合成原料 DNA复制小结 2 参与 复制的模板亲代的DNA双链 66 医药交流PPT DNA复制小结 3复制过程复制是从特定位点开始的 可以单向或双向 双向为主 复制的方向为5 3 特点是半保留部连续的方式进行 复制过程可以概括为 1 双链的解开 在复制的原点双链解开形成复制叉 两条单链各为模板 合成互补链 在复制叉上结合着有关的酶及辅助因子 2 RNA引物的合成 引发体在复制叉上移动 识别合成起始点 引发rna引物的合成 再ATP供能下以DNA为模板按5 3 方向合成一段引物RNA 67 医药交流PPT DNA复制小结 3 DNA链的延长 RNA引物合成后 在DNA聚合酶催化下 以dNTP为底物进行DNA新链的合成 合成的模板是亲代的DNA链 按碱基配对原则进行 亲代的DNA双连呈反向平行 一条链是5 3 走向 另一条链是3 5 走向 4 切出引物 填补缺口 连接修复 随从链的冈崎片断到一定长度 其3 羟基端与前一个冈崎片段的5 端连接时 在DNA聚合酶I的作用下切除RNA并合成一段DNA填补上 在DNA连接酶的作用下 连接相邻的DNA链 修复掺入DNA链的错配碱基 从而形成两个DNA双螺旋分子 68 医药交流PPT 4 复制中所需的酶和蛋白质 1 RNA聚合酶 引物酶 2 DNA聚合酶DNA聚合酶I5 3 聚合酶3 5 外切酶5 3 外切酶DNA聚合酶III5 3 聚合酶3 5 外切酶5 3 外切酶DNA聚合酶II5 3 聚合酶3 5 外切酶 3 DNA连接酶 4 拓扑异构酶 旋转酶 拓扑异构酶I使双链DNA中一条链断裂 减少负超螺旋拓扑异构酶II使双链DNA中两条链断裂 引入负超螺旋 5 解螺旋酶 解链酶 水解ATP 使DNA双链打开 6 单链结合蛋白 SSB 7 引发前体 DNA复制小结 69 医药交流PPT 第二节反转录作用 reversetranscription 1970年Temin等在致癌RNA病毒中发现了一种特殊的DNA聚合酶 该酶以RNA为核板 根据碱基配对原则 按照RNA的核苷酸顺序 其中V与A配对 合成DNA 该过程与一般遗传信息流转录的方向相反 故称为反转录 催化此过程的DNA聚合酶叫做反转录酶 reversetranscriptase 后来发现反转录酶不仅普遍存在于RNA病毒中 哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞中也有反转录酶 70 医药交流PPT 71 医药交流PPT 反转录酶的作用是以dNTP为底物 以RNA为模板 tRNA 主要是色氨酸tRNA 为引物 在tRNA3 末端上 按5 3 方向 合成一条与RNA模板互补的DNA单链 这条DNA单链叫做互补DNA complementaryDNA cDNA 它与RNA模板形成RNA杂交体 随后又在反转录酶的作用下 水解掉RNA链 再以cDNA为模板合成第二条DNA链 至此 完成由RNA指导的DNA合成过程 72 医药交流PPT 携带反转录酶的病毒又称为反转录病毒 它侵入宿主细胞后先以病毒RNA为模板靠反转录酶催化合成DNA 随后这种DNA环化并整合到宿主细胞的染色体DNA中去 以原病毒的形式在宿主细胞中一代代传递下去 又发现许多反转录病毒基因组中都含有癌基因 如果由于某种因素激活了癌基因就可使宿主细胞转化为癌细胞 73 医药交流PPT 大多数反转录酶都具有多种酶活性 主要活性如下 DNA聚合酶活性 RNAase活性 DNA指导的DNA聚合酶活性 除此之外 有些反转录酶还有DNA内切酶活性 这可能与病毒基因整合到宿主细胞染色体DNA中有关 反转录酶的发现对于遗传工程技术起了很大的推动作用 目前它已成为一种重要的工具酶 用组织细胞提取mRNA并以它为模板 在反转录酶作用下合成出互补的DNA cDNA 由此可构建出cDNA文库 cDNAlibrary 从中筛选特异的目的基因 这是在基因工程技术中最常用的获得目的基因方法 74 医药交流PPT 第三节DNA的损伤与修复 DNA存储着生物体赖以生存和繁衍的遗传信息 因此维护DNA分子的完整性对细胞至关重要 外界环境和生物体内部的因素都经常会导致DNA分子的损伤或改变 而且与RNA及蛋白质可以在胞内大量合成不同 一般在一个原核细胞中只有一份DNA 在真核二倍体细胞中相同的DNA也只有一对 如果DNA的损伤或遗传信息的改变不能更正 对体细胞就可能影响其功能或生存 对生殖细胞则可能影响到后代 所以在进化过程中生物细胞所获得的修复DNA损伤的能力就显得十分重要 也是生物能保持遗传稳定性之所在 75 医药交流PPT 细胞中能进行修复的生物大分子也就只有DNA 反映了DNA对生命的重要性 另一方面在生物进化中突变又是与遗传相对立统一而普遍存在的现象 DNA分子的变化并不是全部都能被修复成原样的 正因为如此生物才会有变异 有进化 76 医药交流PPT 一 DNA的损伤 一 DNA损伤的原因 77 医药交流PPT 1 DNA分子的自发性损伤 1 DNA复制中的错误以DNA为模板按碱基配对进行DNA复制是一个严格而精确的事件 但也不是完全不发生错误的 碱基配对的错误频率约为10 1 10 2 在DNA复制酶的作用下碱基错误配对频率降到约10 5 10 6 复制过程中如有错误的核苷酸参入 DNA聚合酶还会暂停催化作用 以其3 5 外切核酸酶的活性切除错误接上的核苷酸 然后再继续正确的复制 这种校正作用广泛存在于原核和真核的DNA聚合酶中 可以说是对DNA复制错误的修复形式 从而保证了复制的准确性 但校正后的错配率仍约在10 10左右 即每复制10 10个核苷酸大概会有一个碱基的错误 78 医药交流PPT 2 DNA的自发性化学变化生物体内DNA分子可以由于各种原因发生变化 至少有以下类型 a 碱基的异构互变DNA中的4种碱基各自的异构体间都可以自发地相互变化 例如烯醇式与酮式碱基间的互变 这种变化就会使碱基配对间的氢键改变 可使腺嘌呤能配上胞嘧啶 胸腺嘧啶能配上鸟嘌呤等 如果这些配对发生在DNA复制时 就会造成子代DNA序列与亲代DNA不同的错误性损伤 腺嘌呤的稀有互变异体与胞嘧啶 a 或胸腺嘧啶的稀有互变异构体与鸟嘌呤 b 的氢链形成导致下一世代中G C配对取代A T配对 79 医药交流PPT b 碱基的脱氨基作用碱基的环外氨基有时会自发脱落 从而胞嘧啶会变成尿嘧啶 腺嘌呤会变成次黄嘌呤 H 鸟嘌呤会变成黄嘌呤 X 等 遇到复制时 U与A配对 H和X都与C配对就会导致子代DNA序列的错误变化 胞嘧啶自发脱氨基的频率约为每个细胞每天190个 80 医药交流PPT c 脱嘌呤与脱嘧啶自发的水解可使嘌呤和嘧啶从DNA链的核糖磷酸骨架上脱落下来 一个哺乳类细胞在37 条件下 20h内DNA链上自发脱落的嘌呤约1000个 嘧啶约500个 估计一个长寿命不复制繁殖的哺乳类细胞 如神经细胞 在整个生活期间自发脱嘌呤数约为108 约占细胞DNA中总嘌呤数的3 81 医药交流PPT d 碱基修饰与链断裂细胞呼吸的副产物O2 H2O2等会造成DNA损伤 能产生胸腺嘧啶乙二醇 羟甲基尿嘧啶等碱基修饰物 还可能引起DNA单链断裂等损伤 每个哺乳类细胞每天DNA单链断裂发生的频率约为5万次 此外 体内还可以发生DNA的甲基化 结构的其他变化等 这些损伤的积累可能导致老化 由此可见 如果细胞不具备高效率的修复系统 生物的突变率将大大提高 82 医药交流PPT 2 物理因素引起的DNA损伤射线引起的DNA损伤是最引人注意的 1 紫外线引起的DNA损伤DNA分子损伤最早就是从研究紫外线的效应开始的 当DNA受到最易被其吸收波长 260nm 的紫外线照射时 主要是使同一条DNA链上相邻的嘧啶以共价键连成二聚体 相邻的两个T 或两个C 或C与T间都可以环丁基环 cyclobutanering 连成二聚体 其中最容易形成的是TT二聚体 83 医药交流PPT 2 电离辐射引起的DNA损伤电离辐射损伤DNA有直接和间接的效应 直接效应是DNA直接吸收射线能量而遭损伤 间接效应是指DNA周围其他分子 主要是水分子 吸收射线能量产生具有很高反应活性的自由基进而损伤DNA 电离辐射可导致DNA分子的多种变化 a 碱基变化主要是由OH 自由基引起 包括DNA链上的碱基氧化修饰 过氧化物的形成 碱基环的破坏和脱落等 一般嘧啶比嘌呤更敏感 b 脱氧核糖变化脱氧核糖上的每个碳原子和羟基上的氢都能与OH 反应 导致脱氧核糖分解 最后会引起DNA链断裂 c DNA链断裂这是电离辐射引起的严重损伤事件 断链数随照射剂量而增加 d 交联包括DNA链交联和DNA 蛋白质交联 84 医药交流PPT 3 化学因素引起的DNA损伤化学因素对DNA损伤的认识最早来自对化学武器杀伤力的研究 以后对癌症化疗 化学致癌作用的研究使人们更重视突变剂或致癌剂对DNA的作用 1 烷化剂对DNA的损伤烷化剂是一类亲电子的化合物 很容易与生物体中大分子的亲核位点起反应 烷化剂的作用可使DNA发生各种类型的损伤 a 碱基烷基化 烷化剂很容易将烷基加到DNA链中嘌呤或嘧啶的N或O上 其中鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的N3最容易受攻击 烷基化的嘌呤碱基配对会发生变化 例如鸟嘌呤N7被烷化后就不再与胞嘧啶配对 而改与胸腺嘧啶配对 结果会使G C转变成A T b 碱基脱落 烷化鸟嘌呤的糖苷键不稳定 容易脱落形成DNA上无碱基的位点 复制时可插入任何核苷酸造成序列的改变 c 断链 DNA链的磷酸二酯键上的氧也易被烷化 结果形成不稳定的磷酸三酯键 易在糖与磷酸间发生水解使DNA链断裂 85 医药交流PPT d 交联 烷化剂有两类 一类是单功能基烷化剂 如甲基甲烷碘酸 只能使一个位点烷基化 另一类是以双功能基烷化剂 化学武器如氮芥 硫芥等 一些抗癌药物如环磷酰胺 苯丁酸氮芥 丝裂霉素等 某些致癌物如二乙基亚硝胺等均属此类 其两个功能基可同时使两处烷基化 结果就能造成DNA链内 DNA链间 以及DNA与蛋白质间的交联 氮芥引起DNA分子两条链在鸟嘌呤上的交联 a 交联附近的总图 b 交联部分结构图 86 医药交流PPT 2 碱基类似物 修饰剂对DNA的损伤人工可以合成一些碱基类似物用作促突变剂或抗癌药物 如5 溴尿嘧啶 5 BU 5 氟尿嘧啶 5 FU 2 氨基腺嘌呤 2 AP 等 由于其结构与正常的碱基相似 进入细胞能替代正常的碱基参入到DNA链中而干扰DNA复制合成 例如5 BU结构与胸腺嘧啶十分相近 在酮式结构时与A配对 却又更容易成为烯醇式结构与G配对 在DNA复制时导致A T转换为G C 还有一些人工合成或环境中存在的化学物质能专一修饰DNA链上的碱基或通过影响DNA复制而改变碱基序列 例如亚硝酸盐能使C脱氨变成U 经过复制就可使DNA上的G桟变成A桾对 羟胺能使T变成C 结果是A桾改成C桮对 黄曲霉素B也能专一攻击DNA上的碱基导致序列的变化 这些都是诱发突变的化学物质或致癌剂 87 医药交流PPT 1 点突变 pointmutation 指DNA上单一碱基的变异 嘌呤替代嘌呤 A与G的替代 嘧啶替代嘧啶 C与T的替代 称为转换 transition 嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤称为颠换 transvertion 2 缺失 deletion 指DNA链上一个或一段核苷酸的消失 3 插入 insertion 指一个或一段核苷酸插入到DNA链中 在为蛋白质编码的序列中如缺失及插入的核苷酸数不是3的整倍数 则发生读框移动 readingframeshift 使其后所译读的氨基酸序列全部混乱 称为移码突变 frame shiftmutaion 4 倒位或转位 transposition 指DNA链重组使其中一段核苷酸链方向倒置 或从一处迁移到另一处 5 双链断裂对单倍体细胞一个双链断裂就是致死性事件 二 DNA损伤的后果 上述损伤会最终导致DNA分子结构的变化 这种DNA分子水平上的突变 mutation 是整体遗传突变的基础 归纳DNA损伤后分子最终的改变 有以下几种类型 88 医药交流PPT 突变或诱变对生物可能产生4种后果 生物发生突变或诱变的可能后果 有利于物种生存的结果 使生物进化 改变基因型 genotype 不改变表现型 phenotype 某些功能丧失 致死性 89 医药交流PPT 二 DNA修复DNA修复 DNArepairing 是细胞对DNA受损伤后的一种反应 这种反应可能使DNA结构恢复原样 重新能执行它原来的功能 但有时并非能完全消除DNA的损伤 只是使细胞能够耐受这种DNA的损伤而能继续生存 也许这未能完全修复而存留下来的损伤会在适合的条件下显示出来 如细胞的癌变等 但如果细胞不具备这修复功能 就无法对付经常发生的DNA损伤事件 就不能生存 所以研究DNA修复也是探索生命的一个重要方面 而且与军事医学 肿瘤学等密切相关 对不同的DNA损伤 细胞可以有不同的修复反应 90 医药交流PPT 一 回复修复这是较简单的修复方式 一般都能将DNA修复到原样 1 光修复这是最早发现的DNA修复方式 修复是由细菌中的DNA光解酶 photolyase 完成 此酶能特异性识别紫外线造成的核酸链上相邻嘧啶共价结合的二聚体 并与其结合 这步反应不需要光 结合后如受300 600nm波长的光照射 则此酶就被激活 将二聚体分解为两个正常的嘧啶单体 然后酶从DNA链上释放 DNA恢复正常结构 后来发现类似的修复酶广泛存在于动植物中 人体细胞中也有发现 91 医药交流PPT 是一种高度专一的修复形式 只分解由于UV照射而形成的嘧啶二聚体 92 医药交流PPT 2 单链断裂的重接DNA单链断裂是常见的损伤 其中一部分可仅由DNA连接酶 ligase 参与而完全修复 此酶在各类生物各种细胞中都普遍存在 修复反应容易进行 但双链断裂几乎不能修复 3 碱基的直接插入DNA链上嘌呤的脱落造成无嘌呤位点 能被DNA嘌呤插入酶 insertase 识别结合 在K 存在的条件下 催化游离嘌呤或脱氧嘌呤核苷插入生成糖苷键 且催化插入的碱基有高度专一性 与另一条链上的碱基严格配对 使DNA完全恢复 4 烷基的转移在细胞中发现有一种O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶 能直接将甲基从DNA链鸟嘌呤O6位上的甲基移到蛋白质的半胱氨酸残基上而修复损伤的DNA 这个酶的修复能力并不很强 但在低剂量烷化剂作用下能诱导出此酶的修复活性 93 医药交流PPT 二 切除修复 excisionrepair 是修复DNA损伤最为普遍的方式 对多种DNA损伤包括碱基脱落形成的无碱基位点 嘧啶二聚体 碱基烷基化 单链断裂等都能起修复作用 这种修复方式普遍存在于各种生物细胞中 也是人体细胞主要的DNA修复机制 修复过程需要多种酶的一系列作用 94 医药交流PPT 首先由核酸酶识别DNA的损伤位点 在损伤部位的5 侧切开磷酸二酯键 不同的DNA损伤需要不同的特殊核酸内切酶来识别和切割 由5 3 核酸外切酶将有损伤的DNA片段切除 在DNA聚合酶的催化下 以完整的互补链为模板 按5 3 方向DNA链 填补已切除的空隙 由DNA连接酶将新合成的DNA片段与原来的DNA断链连接起来 这样完成的修复能使DNA恢复原来的结构 DNA聚合酶I DNA连接酶 ATP 95 医药交流PPT DNA损伤后重组修复 三 重组修复 又称复制后修复 recombinationalrepair 上述的切除修复在切除损伤段落后是以原来正确的互补链为模板来合成新的段落而做到修复的 但在某些情况下没有互补链可以直接利用 例如在DNA复制进行时发生DNA损伤 此时DNA两条链已经分开 其修复如图示 受损伤的DNA链复制时 产生的子代DNA在损伤的对应部位出现缺口 另一条母链DNA与有缺口的子链DNA进行重组交换 将母链DNA上相应的片段填补子链缺口处 而母链DNA出现缺口 以另一条子链DNA为模板 经DNA聚合酶催化合成一新DNA片段填补母链DNA的缺口 最后由DNA连接酶连接 完成修补 96 医药交流PPT 受损伤的DNA在进行复制时 跳过损伤部位 在子代DNA链与损伤相对应部位出现缺口 通过分子间重组 从完整的母链上将相应的碱基顺序片