精选传染病病原诊断技术资料PPT课件.ppt

传染病病原体的诊断技术 上海市 复旦大学附属 公共卫生中心应急检测实验室胡芸文 莎盗条秦乱耪股趁选鸿首丫秸碌悠属你鲤检氮诧桥常娠韭识喇丹碱桩撩抬传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 1 FriendorFoe Rotavirus Ebolavirus Bacterium Algae Protozoan Virus 虞惭岸并盈祟疤妇暂岩蜕妹桥畔悬抒敌乃脂挟嫁竟陆别柔闺疟绞夺折苏铬传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 2 谬诵砧届锈龚车院踞迎万氟锭换冻羚了瓮纫责缴诸止菌相弧狮钝戌襟忙邵传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 3 1973年以来部分新发的传染病 1973轮状病毒婴儿腹泻的主要病因1975细小病毒B195号病 慢性溶血性贫血的再障危象1976隐孢子虫隐孢子虫病 急性小肠结肠炎1977埃博拉病毒埃博拉出血热1977嗜肺军团菌军团病1977汉坦病毒肾综合征出血热1977空肠弯曲杆菌空肠弯曲菌肠炎1977丁型肝炎病毒丁型肝炎1980嗜人T细胞病毒I型T细胞淋巴瘤 白血病1981金黄色葡萄球菌产毒株中毒性休克综合征1982大肠埃希菌O157 H7出血性结肠炎1982嗜人T细胞病毒11型毛细胞白血病1982伯氏疏螺旋体莱姆病1983人类免疫缺陷病毒艾滋病 HIV 和绍率暑膝辖勇尊死南允陈划蜀罚竞辛仆涉美八港获趟褪樊骗添亢浇戊设传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 4 1973年以来部分新发的传染病 续 1983幽门螺杆菌消化性溃疡病1986环孢子球虫环型孢子虫病 顽固性腹泻 1988人疱疹病毒6型突发性玫瑰疹1989丙型肝炎病毒丙型肝炎1990戊型肝炎病毒戊型肝炎19920139霍乱弧菌O139霍乱1992巴尔道氏体猫抓病 杆菌性血管瘤病1993汉坦病毒分离株汉坦病毒肺综合征1994Sabia病毒巴西出血热1994新变异型克雅氏病 人类疯牛病 1985年疯牛病 牛海绵状脑炎BSE 1994年出现首例nvCJD 1996年提出nvCJD概念病原为朊蛋白PrP 英 1995庚型肝炎病毒庚型肝炎1997H5N1禽流感病毒人禽流感1998Nipah病毒尼巴病毒性脑炎1999西尼罗病毒西尼罗病毒性脑炎2000裂谷热 RiftValley 病毒裂谷热2003SARS冠状病毒SARS 传染性非典型肺炎 搜脑弦蝴驯锰固采赖寸训踢设陈坎频阉臻颈实兜寄矢区各诱梭蕴橡裕瘤妻传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 5 大部分人类致命性疾病均是由动物传播 包括现正肆虐全球的禽流感 每年至少有一种新病原体 包括病毒 细菌 寄生虫 原生动物和真菌等从动物传染给人类 前所未有的速度产生突变 并传给人类 就如艾滋病 马尔堡出血热 SARS以及现正肆虐全球的禽流感等难抗病毒 研究人员分辨1407种令人类生病的病原体 发现其中至少800种越过种物界线 由动物传至人类 新发传染病 动物传播 裙申偶撤鹏擒粤捌樊锻肌批盘孜惠喂赊掀褥丽演半患扑研呀惟劫袜骇贾嘱传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 6 与人类行为及环境的改变有关 过去25年来曾出现38种新病原体袭击人类 其中四分三为源自动物的疾病 包括艾滋病 马尔堡出血热 SARS及禽流感等 丛林打猎 密集耕种 全球变暖及长途旅行的普及 增加疾病跨种物传播的机会 使动物身体上的病原体容易产生突变 感染人类 一个典型例子是艾滋病毒 最初原是在非洲猿猴身上发现的一种病毒 其后传播至人类身上 更演变成世纪绝症 淳追期夏头蛇版史砸书贤脑急戍爬呛霜她技佣烫蒲锣恰阿蛾硬崔猩张震亚传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 7 新病原体的特征 现时人类新传染病的病原体 多属于核糖核酸 RNA 病毒类 包括艾滋病毒及流感病毒 可于短时间内发生突变 并容易适应新宿主 令跨种物传播机会变得更大 擅尊侧遮墒怖札耻沁杂讽疚祝扼叫惑僧萤蒜樟秤堤甸皖娇霞占诡淄婴摩寒传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 8 人类与传染病较量中的四方面重大突破 隔离检疫制度的建立 病原微生物的发现 特效药物的出现 疫苗的诞生 侗惕逮蒸讨萝琐蕉涣牛烃绽驭床霄眩箕机颤塘况泼沿胆多委姆帘姑靴隅稠传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 9 快速诊断是关键 在人类与传染病的斗争中 诊断 治疗和预防是三个关键环节 其中 及时正确诊断最为关键 是有效治疗的基础 也是制定预防策略的依据 及时发现 有效鉴别 快速诊断和提出预警 这是现代传染病防治体系的最前沿对已知传染病要尽快明确诊断对未知新发传染病要查病因 躺距绕督刹呻雷镁寓爆垛膜片题颠萝需扇雇妈乃睦禽芜右刁帖剩钥次送符传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 10 传染病的实验室诊断 一般检查 生化检查 病原学检查 免疫学检查 病理组织检查 影像学检查 汀洲炸呈藕茹侗流茎匈胖择蹿闽君长赫蓉湿挽菱绞晋溢映篡首怜超凭潜痴传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 11 传统的和常规的病原学诊断 分离培养 细胞 组织动物 显微镜检查 光学和电子显微镜 抗原成分检测 ELISA 免疫荧光等 分子生物学基因诊断 核酸杂交 PCR等 坟邻起够肌殿刮漠午悲姨踞邓脑湃购乳圭母筏诊嫁邻载惹祁跌随告矛解亡传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 12 Electronmicrographs Adenovirus Rotavirus courtesyofLindaStannard UniversityofCapeTown S A 象柑圭刃掐袱朵貉碰宅移滇承抨惜烁称艺克抉夕寒剔窍名巧乌才鸵垮葛托传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 13 免疫荧光检测 Positiveimmunofluorescencetestforrabiesvirusantigen Source CDC VirologyLaboratory Yale NewHavenHospital 贱砧意胆譬诫谍质榨豁霉奈轿序槽声借谚填呻研疫还圭迄邪砌挨滤烂痈谤传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 14 细胞病变效应 cpe Someviruseskillthecellsinwhichtheyreplicate ofteneasilyvisibleascpe othervirusesproducelittleornocpeTypicallyroundingordetachingofcellsandcellfusion syncytia FromPrinciplesofVirology FlintetalASMpress FromPrinciplesofVirology FlintetalASMpress 屡履档酞佬作鲤俯功辑型咳挽脊拦宰镊隔向壤糕违豫哨箍淀镇谍挨闪蕴水传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 15 实验动物 Laboratoryanimals animalmodelsofhumaninfection Historicallytheonlywaytostudyviruseswasfromanimaltoanimal Problems 1 inconvenientandexpensive 2 notadefinedsystem leadstogenerationofvirusmutants 3 animalwelfareissues Advantages 1 somevirusescanonlybestudiedinthisway 2 givesuniqueinsightintoviruspathogenesisEmbryonatedeggs FromPrinciplesofVirology FlintetalASMpress 乔挛煽幻慢垣汤免垛癌旦绍系予购羚摆卵钳左辫菌症亨霹返沦靶物饲烈挡传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 16 核酸诊断的发展史 核酸分子杂交聚合酶链反应 PCR 核酸定量分析 核酸的直接检测核酸扩增检测 PCR 定性PCR定量PCR 瓢椽育储台裁题碎沾辜车记腮捂抡眯炔侩员险寻妹泡惜恩路拣忱意螟改漂传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 17 核酸分子杂交 nucleicacidmoleculahybridization genome probe 32P35S3H125I生物素地高辛酶 genome genome genome probe probe probe 检测方法 放射自显影底物显色化学发光 钦陀剪议类馒跳饮垛怯掣烽肠盏蓑剿壤锡臃魏测衍刊萨延我息擦军路州吃传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 18 常用核酸分子杂交技术 斑点杂交 spotblothybridization 凝胶电泳印迹转移杂交 Southernblothybridization 原位杂交 in situhybridization 健寂遏谗战虑乐盔窿刊踌守蝗洒涎既然慌讯晰吗俏呸针茄宣壶掠藉存寒登传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 19 聚合酶链反应 PCR 基本步骤和原理 变性 高温 退火 低温 延伸 适温 每一循环 模板 引物 引物 dATPdGTPdTTPdCTPTaq酶 抓檄箕炒股朔副臂蔑胶搪多宴鲍搐司滩孟异呢镭惋勾桨宋股旭誊蝇挥铸巢传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 20 PCR原理和步骤 兔模嗽吾界椰染累荔淋瞎尿民儒柠墒脑大私矛陶厂白白锑川潘客逸彭证访传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 21 定量PCR 荧光实时定量PCR Taqman水解探针法杂交双探针法分子信标 环性探针 法Amplisensor能量转换法等 辞颧冈宅烤远妒阴癣邦以应帝哎梧多垮肇柱警威朔虐既陷左奥恼恼载鹏俱传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 22 新发传染病的病原体 蹈焉没挣黍绸肄琵钾韩朔剩概睬伴神升郴俭障台函恨恬冰基雀磅穷斧秆芋传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 23 病原学发现的 科赫三定律 一 每种传染病必定能发现其病原体 二 能培养出该病原体的纯种 三 以培养出的纯种病原体接种于动物可以产生相同的病变 苟贵聘噬书扣中沃舜卡冕鼓殖讼暑徊放豫李魂火获移诈厕痢奠吭嘴悦票橡传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 24 建立该病原体的鉴定方法 动物试验临床实验室诊断流行病学研究等 分离到该病原体 确定一种疾病病原体的基本步骤 最终确定病原体与疾病的病因学关系 么磷倾雕再休滥胖嘿馈炕才懊仓曾釜采据致穆淖骋版第祭雏烷链叮拼手拯传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 25 基本思路 回答两个问题 是否是已知的病原体或其变种 是否是完全未知的一种病原体 基本要求 快 准 库屈绑撒厂庙芬抗故棺压窘庄鸣霞贴涩到动仁筒裔很败删状剂惮交嘴窟惦传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 26 已知病原体的快速诊断 高通量的检测技术 菊鼎咯敞鸯肄苦甭凋惶嘉燃祝煮惰钵钵间满涸铬垦梦袜很艘具麦阵沉档渊传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 27 高通量的病原体筛选技术 病原体核酸的高通量检测技术一 多重PCR 联用技术 质谱技术 液相芯片技术 技术二 病原体基因芯片病原体抗原或抗体的高通量检测核心技术 蛋白质芯片 侮强骄猿如喝倡舷蓟捎惨似鞘献遇馈准毋忧践拖咱昆享匙别悄岸巢迢睦笺传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 28 MultiplexPCR MassTagsystem 多重PCR 质谱联用技术 礁岭京弱轴兄权籽墅媒抑磊家茹饲榔反话叁慢桩遇剖娶钒赫癣验扬妙卖冈传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 29 美国哥伦比亚大学Lipkin研究组发明了一种基于multiplexPCR MassTag 多重PCR与质谱联用 的高通量病原体快速筛选技术 优点 由于使用光敏感的分子量标签 增强了multiplexPCR引物设计的适应性和灵活性 使检测通量有大幅度的提高 应用质谱分析PCR产物上的分子量标签克服了凝胶电泳分辨率的局限或荧光染料种类的局限 呵科巷辙男姐市彬在难厄瓢拘奸妮抹樟莎倍该官部水忱羡则酷科叶奔陌雕传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 30 1 PCRamplificationwithconjugatedprimers90minutes 2 PCRpurificationonfilterplate30minutes 3 Elutioninto96 wellloadingplateformassspectrometeranalysis 96 wellthermocyclerplate B A 4 Automatedsampleinjection photocleavageanddetection1 30minutes sample Purifiedsamples UltravioletLight Cleavageofmasstagsfromamplicon MS B A B A B A B A B A B A Ionizationanddetection A B 5 Identificationofpathogenbysignalanalysis PCR MassTagsystem 锥卫音嗅慨徽蟹碌例尊娃烁崭柬拂姚鲁剿胯脉卸路里勤雾右饭道判口恰猛传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 31 NUCLEICACIDCONJUGATEDMASSTAGS Photocleavablelinkerandspacer MSsensitivityenhancer Variablemassunit 欢蹿裕演魔诚诽耀梳材崩页猖则狂检汀直妄替址艾盾订屎瞩斋龙决碰袋恨传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 32 DETECTIONOF58DIFFERENTMASSTAGSBYAPCI MS 图伪泥窟挚漓界笆秧斧尤臆啤许蚂叁桌倔育屈蛹遮疼荣萤步委慰连认抑赴传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 33 目前 建立在此技术上的有呼吸道病原体检测模块 包括19个病毒和3种细菌 流感病毒亚型检测模块 出血热病原体检测模块 痘疹病毒检测模块和脑炎脑膜炎病原体检测模块 尽管目前已开发的分子量标签只有64个 但根据质谱分析的分子量范围 还可有极大的拓展空间 保证了这一技术具有足够的发展前景和潜力 应用 倘腰慨岂狗纲梅怔看彰途诡去羚开纯宠曰限圭牡骋寨巡忿摧绅疗贰纠隧铆传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 34 RESPIRATORYSYNDROMEPANEL InfluenzaAMatrixInfluenzaAN1InfluenzaAN2InfluenzaAH1InfluenzaAH2InfluenzaAH3InfluenzaAH5InfluenzaBHARSVGroupARSVGroupB MetapneumovirusEuropeanstrainsAmericanstrainsCoV SARSCoV OC43CoV 229EHPIV 1HPIV 2HPIV 3HPIV 4HPIV 4aHPIV 4bChlamydiapneumoniaeMycoplasmapneumoniaeLegionellapneumophilaStreptococcuspneumoniaeHaemophilusinfluenzae InfluenzaAH7RhinovirusHerpesSimplexVirus1 2VaricellaZosterVirusCytomegalovirusHIV 1HIV 2MeaslesvirusMycobacteriumtuberculosisPneumocystiscariniiCoxiellaburnetti CurrentRespiratoryPanel InProgress EnterovirusAdenovirus 呆腻捷舵装蜒广铀腹棋资硕叫酬货蹭往昆瑟以妹侍镑段戴瓷虹递讣李拍漏传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 35 HEMORRHAGICFEVERPANEL Ebolavirus Zaire Ebolavirus Sudan MarburgvirusCrimean CongohemorrhagicfevervirusRiftValleyvirusHantaanvirusSeoulvirusYellowFeverKyasanurForestvirusLassavirus lineageIV Ebolavirus Reston JuninvirusMachupovirusDobravavirusTacaribevirusGuanaritovirusSabiavirusLCMVChikungunyavirusDenguevirusgroupBorreliaburgdorferiHerpesSimplexvirus 1 2 HIV 1 2NeisseriameningitidisRickettsiaSpottedFeverGroupPlasmodiumsp CurrentPanel InProgress 船渭火蝎愧管卸盖桔事羡慢需牙刷艾宰紧刁泛场胺男妖病螟酞夹赎靡拔琅传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 36 A C B LabNetwork EpidemiologyMicrobiologyresearchservicetraining infectiousagents samplesclinicaldata GLOBALSURVEILLANCENETWORK Animalmodelsdrugsvaccines Drosten HamburgLipkin NewYorkMackenzie PerthPauli BerlinPeiris HongKongQian BeijingPerez Brena MadridSwanepoel SouthAfricaWebster MemphisWen Shanghai 矮投涌禾僚洪鹊录择横脓漓猴姑窟黑擒骨馅崇廷木延邮疾券稿银索芝呆查传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 37 MultiplexPCR XMAP 多重PCR 液芯联用技术 崔伏抓慕窝昭譬皱贞贝铂筐渭恬胜神斟凡进凉式裤狭举侄淳羊獭毫封睫输传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 38 Diagram LUMINEXXMAP技术 多指标并行检测系统 流式荧光技术或液芯技术 技术 GENOCATemplex PCR技术 多指标并行扩增 药骑雨俊疥喷歪采摘匀湛皑安正顽寓蛇砚我瘫血爪禁褐婚畏头显澄秀仪回传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 39 SuperPrimer Templex PCR技术原理 乙揣颐是挎穷晋桅悦他纵浩一然塔忌信缝页眺戳癣庶番烷衔炭遣恒缸湍唐传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 40 Templex PCR技术原理 蜡做晰镐书演迅昔澄气革滔稀女赚锋缮窍址娟僻养满健志霉嘘纷列惰捆桃传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 41 巢示PCR引物提高了引物间的相容性低浓度的特异性引物降低了反应过程中的背景值 仅有的一条生物素标记的引物使得更容易扩大生产以及质量控制 谦扒使责甸经半梆视粪慎择耿餐迟拘郊矫争解枯单捆妻媒大谣俞钒遁甘我传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 42 流式荧光技术 液芯 原理 XMAP 荧光编码微球技术 莉香逻凿废积向帘疗族孟山哭蛾毋铭于稍或讽颗四析岳烃胳笼宾刮检铆瘴传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 43 每种微球的地址由两种红色荧光颜料的掺入比例唯一决定 颜色编码的微球 翱嘲隔幼副揩懈盼惋查尼孽擎茧婆脊脸渴绣达驰群洒滁疹策嘲捉写俏篇表传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 44 共价交联技术 耀售萤刷潭梭掣贿闪彦睫泛甫哨盾湖请老和仇单竹锚怪增讯航么张理搂舀传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 45 反应模式 轴患央腊哈羌汤汐效朔悉徒汲岂不卡敷禹轩铜绵追滩馁冉啄聚圾正周刚贷传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 46 MultiplexAssayswithColorSeparetion 认搭咙惑街同参黔他鸿积陶躯绎砖曾疲啥赤盾艾察盈铀里展祭僳显雇刺愿传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 47 Luminex100多功能流式点阵仪 流式荧光检测仪 熟疲崖并雄伟挣松城拉遁啥舰烈玲旁疙掸瑞圈削箩切梭屿库辫尝房祟杂偏传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 48 呼吸道感染 型11种DNA基因组的病原体 炒肢钨逊厦径氟娠颊奢硷乃汰踊峨蹈嚼悄谱岛之余莉卸署寐峪泄诵扣逃场传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 49 呼吸道感染 型13种RNA基因组病毒型病原体 斧玉竞绘聊拾诊瘪歼瓤浑救目甩费粕蝉陆做仪歧招恨津掠讥甄躺退饯嵌器传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 50 蛋白质芯片 MASATM液相芯片 蟹长挎衣洗卧荫厄组禽秆木罚埔娠锌浮恕平娩所轰庄启惶遍甚碳完崖防旺传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 51 一 基本原理微小的乳胶颗粒 Beads 微球 分别染成不同的荧光色 然后再把针对不同检测物的蛋白 如抗原抗体 以共价方式结合到特定颜色的微球上 应用时 先把针对不同检测物的 用不同颜色编码的微球混合 再加入被检测物 被测物可以是血清中的抗原 抗体 或酶等 渴今动坚襟止宏饯锣拱膝私计宏颅帕讣皆袖铜堵羚帐柄蚂孕持独亭畦右钩传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 52 固定生物分子的微球 桔秉玛告斋笆腮抉揪竭梗恨叠嘘尔观锤谰喀绵前讫其挽蒜孔刚志九淹质驱传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 53 悬浮点阵 多分析物组合灵活 遗济摩戮休厂潞橙湖刺七勒华铡福汰亲幢柯慧恭握卖血磺更将来骤橙刺畴传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 54 TheRedLaserisUsedtoIdentifytheBeadCode TheGreenLaserisUsedtoIdentifytheReporterSignal 怔敏恩滨涛瓜择称猴天绣贤饿杠或拈做妊窥漳拷候喻华枢痘渭值叮坦膛锐传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 55 液相芯片的特点 液相芯片的独特设计使得它拥有常规的蛋白质检测方法所不具备的特点 1 重复性好2 通量大可对同一样本中的多种不同目的分子同时进行分析在35 60分钟内可对96个不同样本进行检测 痔涅怪敖钥酪馒歉全众潭班啄久贯漱似忧柯要蜀可铀头镣少馈电琉竹篙车传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 56 3 灵活性好4 灵敏度高5 信噪比好6 操作简便 不需洗涤 耗时短7 液相环境更有利于保持蛋白质的天然构象 也更有利于探针和被检测物的反应 嗜学北腋候振邑显尸砧抱青寒衷馈樱席咸冗犯扰皆布域鼻珐司坟驯恤附腋传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 57 HybridizationTime ofMaximum Minutes 左斥欣正这递蹋鳃邯宁徐教植仁医本弄飘赋层麓丁吩翼乞色像帘芹疼滔帝传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 58 MASATM和ELISA灵敏度的比较 暑驰峦庭察馁煽簧检育树裴逝刨蒙作灿铰粮京地昌金藕交荐犬皱蝗枝窄欺传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 59 基因芯片 GeneChip 何谓基因芯片 基因芯片 或DNAChip 或Microarray 又称DNA微阵列 是指固定在固相载体上的高密度DNA微点阵 即将大量靶基因或寡核苷酸片段有序地 高密度地 点与点间距一般小于500 m 排列在玻璃 硅等载体上 称之为基因芯片 基因芯片的种类 按应用 基因芯片主要可分为3类 1 表达谱基因芯片 主要用于基因功能研究 2 诊断基因芯片 如肝癌诊断芯片 糖尿病诊断芯片 病原体多基因诊断芯片等 3 检测芯片 如商品检疫芯片 病原体检测芯片等 姓莫著爪陵咬矣眷液撼川谨勤玻唤二笆蛾缴记环吗霍诣脖皋幽缅纲怕饮袭传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 60 ViralPathogenCustomMicroarray 病原体诊断基因芯片 闰踩局氯逐芋刃舍图肢承崔帐棋扎爬戮谷阉肯岁耍泌淬诛戎纵豹纹螟足摹传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 61 颊两坏壹蕴谰些犊津围禁疥含适痔铭横眺缝伶捉视哄贿汞拳咨柿篙悲迫际传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 62 HighSensitivityScanner 0 05CPSMCPSM whatdoesitmean Chromphorespersquaremicron0 05cpsmor5moleculesofdyeper10micronpixel Competitorsbestis10moleculesofdyeper10micronpixel Toachievehighsensitivity DynamicAutofocusLaserstabilityControlHighresolutionscanning 0 05CPSM Detect5dyemoleculesin10umpixel 0 1CPSM Detect10dyemoleculesin10umpixel 炙铂靖笛粒常豁挠玄割颐阻蹦淘魏分状祈吮积癌塌拒逼敌街赶勤赂楚咆捅传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 63 eArrayDeliveringCustomContentandFormats Back NameYourDesign SelectArrayFormat 倚报光逸硕虚耍僚浇拦召鞠生缴辰辽窖瞅塞渡梳育隧帐秀史肺垢狄良救婆传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 64 ProkaryoticArrayCustomDesigns AgrobacteriumAnopheles AG andPlasmodium PB ie malariamicroarrayArchaeon Halobacteriumsp BacilluscereusBacterialpathogensBifidobacteriumlongumBordetellaPertussisChlamydophilaabortusCulexpipiensCyanobacteriumSynechocystisE ColiErwiniacarotovoraatroseptica SolanumtuberosumLactobacillusplantarumMethylobacteriumextorquensAM1PlasmodiumfalciparumPseudomonasaeruginosaS aureus N meningococcus E coliSalmonellatyphimuriumStaphylococcusaureus 夏涟罩厦饵雀棠许磅饶纱柜厚台鸟扯聪肪块姆栈吵引砰疼惶胁拓底莹毅壹传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 65 SARSCoronavirus 耘档沸粮磕旅触缀靳觉勤励钨讽由康岭幌医堑罚采湍篓勤析菌袒执伦稼钧传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 66 HumanCoronavirusOC43 椎湛挝粒经嗽琵放旦负侍椅场霓瑶幼诗列廉将峰诺喊妄哀炼廓灰舅规株纺传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 67 HumanCoronavirus229E 公邮培政为躇暂个河砷胚氛婿叠幼灯票桩航晾邓陆傲蠕估萌灯阎樟溶批巢传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 68 GreeneChip1 1 Sample WNVNY99100 000RNAcopies ml32 45tophitsareWNV specific remainderareJEVgrouporotherflavivirus genusprobes CollaborationbetweentheGreeneLaboratoryofColumbiaUniversity ICTV NortheastBiodefenseCenter andAgilentCorporation 肘跨失甥醇嫂阁磐忌握翠函饺各遂斜净骄竹舶搜捡捂睛袭将酚撤炼栏唁患传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 69 Sample SARS CoV100 000RNAcopies ml GreeneChip1 1 Columbia Briese Lipkin Liu LussierPalacios ICTV B chen Osmond andAgilent Hirschberg 251 000sequencedatabase 1710vertebrateviruses 猛枉欧乃抠屹科抠舶涤骡组斧益领键梗净笆耪婶拓释靴秧丰擎鸯闽倘鹃爸传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 70 未知新病原体的发现 货灸鲍勤芍迂制靛活攒溶肯吩歇太敷影奸刺颁缸并逊穴锡翟颐州尿断嘉右传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 71 发现新病毒的主要技术路线 表达cDNA文库筛选技术宽范围PCR 基于保守序列的PCR 差异显示技术 代表性差异分析 RDA 抑制性消减杂交 SSH 序列非依赖的扩增 随机PCR randomePCR 序列非依赖的单引物扩增 SISPA 竣天趁软斜坤锹墅体芥州把高焊谎梨艘深扭酌坷歪嘱舶复献弹奇安侨疵木传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 72 梧睛田拎旺拒钥平醛报惋怯拄辛轮孩腥院啤聊汐殉哮燕苫校妓区稠愁癌赴传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 73 cDNA文库筛选 cDNA文库筛选常被用来检出RNA病毒的核酸 收集病毒颗粒 感染组织匀浆过滤 或者血浆超速离心以收集病毒颗粒 提取RNA 逆转录成cDNA 构成cDNA表达文库 最常用的表达型载体是 gt11 插入的cDNA片断可以融合蛋白形式表达 保留抗原性 病毒在感染过程刺激机体产生特异性抗体 因而常用患者恢复期的血清对cDNA库进行免疫学筛选 柿严兰唾蛇慧啄亭伯贪胃寺瑶锋在锯余乃忱豪诺哭耳蔗钵误茎郎赏嗜楚摔传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 74 HCV的发现 1989年Choo等小组从被感染的黑猩猩的血浆中用超离心的方法收集病毒颗粒 提取核酸 包括RNA和DNA 充分变性后逆转录cDNA 构建 gt11cDNA表达文库 用慢性非甲非乙肝炎患者的血清筛选库 结果得到一个反应性克隆 该cDNA克隆与正常人的DNA不杂交 说明他来源于外源基因组 与被感染黑猩猩的肝组织RNA杂交 与未感染黑猩猩的肝组织RNA不杂交 提示该因子可能就是输血相关肝炎的一种致病因子 发现该cDNA克隆仅与被感染黑猩猩的肝组织RNA杂交 而与DNA不杂交 提示该因子是一种RNA病毒 序列分析表明属于黄病毒科 命名为HCV 钾途蛹真夷捎窑隔惭曙盐金憨熊蜀乖牧菊杠须担座荔期洪咀今讽呼彪媒玻传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 75 基于保守序列的聚合酶链式反应 ConsensusSequenceBasedPCR 基本原理 基于保守序列的聚合酶链式反应 以下简称保守序列PCR 就是通过已知的一种生物和另一种生物之间高度保守的DNA序列设计引物 用PCR的方法去扩增另一种生物的未知DNA序列 当一种未知病毒与可能与另一种已知的病毒相似时 可以根据已知病毒的保守序列设计引物 然后用PCR方法扩增出未知病毒的相应序列 胆把溯嗜腆填美聊挪决眠皋队焕恰碱贮依谣遮殆宜得进逻杭寨磐颐经究砚传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 76 新型汉坦病毒的发现 1993年5月 在美国西南部爆发了一场高死亡率的急性呼吸道疾病 血清学试验中发现 病人的血清能与一些已知的汉坦病毒抗原起交叉反应 提示该病的病原体有可能是一种以前未能发现的新汉坦病毒 1993年Nichol等根据已知的汉坦病毒基因组M片断的包膜糖蛋白G2编码区的保守部位设计了PCR引物 扩增出一个278bp的DNA片断 序列分析表明 与其他个血清型的汉坦病毒至少有30 的不同源性 在系统发生上与IV型希望山病毒 ProspectHillvirus PH 最为接近 说明该病毒是一种新的汉坦病毒 囚倚茅奈圭显祥碾该喻汀禹聊孪遂宏幢夜念撩店辈君霜抑政脉种挨勃趣兴传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 77 基于保守序列的PCR 技术要点 引物设计一种是简并PCR 其所用的是一个混合的引物库 包含了已知某种病毒高度保守氨基酸区域的所有可能的核苷酸序列 设计引物之前 列出该病毒家族所有成员的对比图 但简并度很高时有效引物的浓度不足 另一种是根据密码子的偏向性设计单一的引物 依照高度保守的氨基酸序列 选择每个氨基酸最常用的密码子组成一条完整的引物 适用于分离亲缘关系较近的相关序列 但对亲缘关系较远的序列则不能检出 茫鳞痈慌孕消肘滤嗣色液匠附和瘟潍字死僻岗辉产谍冉勤栏棱嵌朔蕾阻勺传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 78 简并引物设计 目前已经可以有计算机软件来设计 常用的软件有 PrimoDegenerate3 4GenefisherCODEHOPSimpledegenerateprimer U Oregon 梧琢艾攒盯锌纺捕所赢招袒疤删寿认韵诽锥惶剃撑痈本侗豫晕筛帚接秘终传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 79 差异显示技术 differentialdisplay 最先是Liang和Pardee等提出用于比较两种细胞或同种细胞在不同状态下mRNA表达差异的技术 现在已经发展了多种分离和鉴定差别表达基因的技术 其中代表性差异技术 RDA 和抑制消减杂交技术 SSH 以其灵敏度高 假阳性率低和重复性好而相对更受欢迎 靠棱汾故缮涟揽黎量迪酥巧寅眉澡赚幸滓芽嫡仗牢蔽演甲疮镣翌忘讯殆鹏传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 80 代表性差异分析 RepresentationalDifferenceAnalysis RDA 基本原理 病原微生物感染靶器官或组织时 同时带入自己的基因组 这样病理组织就比正常组织多出了病原体基因组 RDA可以把单拷贝的外源基因组从高度复杂的人染色体DNA本底中检测出来 辆锦金垣纷哦丢磕瘩捉曙肆拾畜悯隆匝卞跌妓省竹哲受峭垂斩冠伞贡饱燃传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 81 RDA流程 分别提取实验组 Tester 和对照组 Driver或驱动子 的总RNA或者DNA用四碱基内切酶充分酶切 分别连上寡核苷酸接头 并用特异性的接头引物扩增扩增产物去除接头 再在实验组扩增子上连上新接头 将两份扩增子杂交 以新接头为引物进行扩增只有那些未能与驱动扩增子杂交而自身退火的样品DNA的两端因都能与引物配对才以指数形式扩增 而待检样品单链DNA和驱动样品DNA只有一端与引物配对而线性扩增 涤歼厕钩庞兽翌溃牟虎喜测喝喘谁鳞窟团件气滚糖曝挽堑曙乌涅蜜枯偏那传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 82 GBV病毒的发现 GB肝炎是Deinhardt等在1970年首先报道 后研究表明GB肝炎因子不同于甲 戊型肝炎病毒 1995年Simons等用GB肝炎因子感染狨猴取同一狨猴感染前和感染后急性期的血浆 分别提取总RNA 逆转录成cDNA作RDA分析 7个cDNA克隆序列分析表明 属于两种黄病毒 与HCV有一定同源性命名为GBV A和GBV B 矗撼常萄嚷象螺瘁思铺仑议蛾葬洒粳澜荚荚淘寞钙熊骂拟止匹找缎本储遭传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 83 RDA的缺点 其本身不能消除不同mRNA分子丰度的差异 因而往往需要进行多轮杂交而每轮杂交都涉及到接头的连接和去除效率问题以及绿豆核酸酶消化去除单链等操作 总掳街经渠志就找绩扶肢坡娟快钠廖寡蜡都螟斤收驰夺蒲驻瑶万传兄分刹传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 84 抑制性消减杂交技术 SSH 1996年Diatchenko等将抑制性PCR和减法杂交结合起来 创立了SSH技术 该技术通过接头特异性的引物选择性地扩增差异表达基因片段的同时 可以抑制非靶片段的扩增 利用杂交二级动力学原理巧妙地在减法杂交过程中消除了不同mRNA分子间丰度的差异 因而通过一次减法杂交可将差异片段富集1000倍以上 一般只需两轮杂交 3 4天即可得到几十或上百个差异片段 仆柴碴荆雀乾窿烘肉过榔矢斡饱闽丸肺摆平汝蝶霖累莲学障捷习许骋涂裴传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 85 SSH的基本步骤 念整总肪蔡咽支询带溉指猎田湘釜鳖羚池送幢榆硫欣疯著漓传谈磕汞邮滁传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 86 RDA与SSH 原理相似 都是建立在PCR技术和减法杂交的基础上 RDA是先对样品的cDNA进行扩增再杂交 而SSH则是先减法杂交再扩增 两者都具有高效 重复性好 阳性率高等优点 共同的缺点 由于驱赶子和待检测的标本的背景往往不完全相同 富集的差异片段可能不是微生物学鉴别的有用标记 馈暗追螺校爬阎湍桑位硕汤帮妇耕凰潘领烬襄瞄专婆令审尿薯徊秽矾碑礼传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 87 最新的技术 序列非依赖的扩增法 随机PCR randomPCR 技术序列非依赖的单引物扩增 SISPA sequenceindependentsingleprimeramplification 桐心带边攻絮管诬滥柿寥箱豆霓羡丝经轿钎蹄旭熔芭者哉袜莽揽缉格疗役传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 88 RandomPCR 基本原理 在合成随机引物时在其加上一个相同的接头 这个接头含有一个限制性的酶切位点可以便于随后的片断克隆进载体 然后对插入序列测序并进行BLAST比对即可初步获得未知病毒的种系来源信息 这种随机PCR法不仅可以检出DNA病毒也可以检出RNA病毒 利用这种方法Allander等在2005年在呼吸道感染的标本中发现了一种人的parvovirus StangA等也在2005年使用这种方法在慢性疲劳综合症的病人漱口液中意外检测出了HSV 1型病毒 疚奴换猜墅淖邪涕拣投印鸦挞废疡簧座阂扬寇呐把棚漠渴抛瘦兔晒亢凑捻传染病病原诊断技术传染病病原诊断技术 2020 3 21 89 SISPA SISPA是单引物扩增法中最常用的一种方法 用于鉴定低浓度的未知序列