miRNA在基因表达调控中的作用(精).ppt

MicroRNA在基因表达调控中的作用 一 怎样定义miRNA 成熟 1 长度为22nt的转录体 可通过northernblot等方法检测得到 2 其前体为典型的发卡结构 miRNA位于发卡结构的茎部分 3 通过Dicer酶的处理后生成 4 序列具有高度的保守性 二 miRNA的生成过程 注意事项 1 通过RNA聚合酶II转录生成 具有mRNA的结构特征2 可以是多顺反子结构 即一条pri miRNA包含多个成熟miRNA的信息 3 在判断一非编码蛋白质的mRNA是否生成miRNA时 我们可以通过抑制Drosha的活性 观察pri miRNA的含量是否增加 4 miRNA可来源于外显子 也可来源于内含子和非编码序列 5 miRNA在基因组DNA上成族分布 处于同一族的miRNA常共表达 三 miRNA的作用机制及功能作用机制 与靶基因mRNA3 非翻译区通过不完全配对结合降低mRNA稳定性或抑制靶基因的翻译 此外 miRNA也可与5 非翻译区和编码区序列结合调节靶基因的表达 有文献报道 miRNA可与mRNA3 非翻译区的其他部位结合 升高mRNA的稳定性 注意事项 1 由于miRNA与靶序列是通过不完全配对结合 因此证实miRNA的靶基因成为一难点 2 一种miRNA常有多个靶基因 功能 miRNA主要通过抑制它的靶基因来起调控作用 miRNA的作用遍及生命体的发生 生长 发育 分化和死亡的过程 Lewis等人的预测结果发现 预测的miRNA的靶基因多数是参与转录 信号转导 肿瘤发生的基因 虽然miRNA的作用也是特异的 特别是5 端的2 8个碱基 特异性的靶向与它的靶基因 但是与siRNA不同的是miRNA的特异性并不是那么强 在生物体内往往一个miRNA作用于多个靶基因 6 对于同一家族miRNA 其功能常具有互补作用 比如 在MYC诱导的B细胞淋巴瘤小鼠模型中 剔除miR 17 92族DNA序列可诱导凋亡 如果导入此族中的任意一种miRNA均可减轻细胞凋亡 7 不同miRNA可同时调节同一靶mRNA 1 miRNA与细胞增殖 apoptosis 抑制cytokinesignaling 2 miRNA与细胞凋亡 3 miRNA与细胞信号传导 四 microRNA表达的特点 1 时间特异性 在高等生物 microRNA的表达在生长发育的不同阶段是不同的 2 组织特异性 在不同的组织中 microRNA的表达不同的 四 寻找miRNA基因 1 Forwardgenetics 2 MiRNAcloning 3 ComputationalapproachestomiRNAdiscovery 五 检测miRNA表达的方法1 Northern杂交2 Real timeRT PCR 3 基因芯片的方法 六 怎样预测miRNA的靶基因 第一种方法 过表达或抑制miRNA的表达 利用基因芯片筛选出差异表达基因 从这些差异表达的基因中 证实miRNA的靶基因 注意事项 1 并非所有的差异表达基因都是miRNA的靶基因 许多差异基因表达的改变是由靶基因表达的改变而引起 miRNA 转录因子p53 P53的靶基因 P53的靶基因不是该miRNA的靶基因 2 该方法不能证实miRNA所有的靶基因 根据miRNA与靶基因mRNA3 UTR的配对程度不同 miRNA可降解靶基因mRNA 配对程度高 也可不降解靶基因mRNA 配对程度低 但抑制mRNA的翻译 第二种方法 由生物信息学预测miRNA的靶基因 预测miRNA靶基因的网站 http www microrna org mammalian index html http pictar bio nyu edu http www microrna org microrna home dohttp www targetscan org 注意事项 根据背景知识 选择两个或两个以上网站均有预测的靶基因做进一步分析 七 怎样证实miRNA的靶基因 5 UTR 3 UTR ORF AAAAAAAAA 靶基因mRNA PCR扩增3 UTR 克隆3 UTR到报告基因luciferase下游 luciferase 3 UTR 报告载体 将重组载体转染细胞 观察过表达或抑制miRNA后 luciferase活性是否改变 为进一步证实miRNA确实调节该靶基因 还需完成以下实验 1 突变3 UTR上与miRNA结合序列 主要是种子序列 观察突变后的3 UTR可否废除miRNA对luciferase活性的影响 2 观察过表达或抑制miRNA后 内源性靶基因mRNA和蛋白质水平是否相应改变 3 miRNA与靶基因功能相关性的研究 八 miRNA表达调控与肿瘤miRNA在基因组DNA上拷贝数的改变 扩增 转位和缺失 比如 1 在B CLL中 miR 15a 16 1族区域DNA出现缺失 2 在淋巴瘤细胞中 miR 17 92族区域DNA出现扩增 在胶质细胞瘤中 miR 26a出现扩增 3 在T ALL中 miR 17 92出现转位 2 miRNA合成的影响3 miRNA的转录调控 1 转录因子对miRNA的调节作用 2 DNA甲基化对miRNA的调节作用