流式细胞术在肿瘤学中的应用PPT课件.ppt

流式细胞术在肿瘤学中的应用 1 内容 流式细胞仪概念 原理及应用流式细胞术优势流式细胞术在肿瘤学中的应用 2 流式细胞术 FlowCytometry 是利用流式细胞仪检测细胞或其它颗粒性物质的物理 化学特性 同时利用荧光染料 激光技术 单抗技术以及计算机技术的发展 大大提高了检测速度与统计精确性 而且从同一个细胞中可以同时测得多种参数 为生物医学与临床检验学发展提供了一个全新的视角和强有力的手段 流式细胞术 3 流式细胞仪检测流程 4 流式细胞术优势 分析型 高速测定细胞 大样本计数检测稀有细胞多参数分析 5 FC500流式细胞仪 6 流式细胞术的应用 检测特性 大小 颗粒度 细胞受体 分子 核酸 DNA RNA 蛋白 7 肿瘤学中的应用 肿瘤免疫肿瘤细胞周期和凋亡肿瘤干细胞的研究血液中循环肿瘤细胞的研究 8 肿瘤免疫学 天然免疫中性粒细胞嗜酸性细胞嗜碱性细胞单核细胞 巨噬细胞树突细胞 mDC pDCNK细胞NKT细胞 T淋巴细胞CD5 B细胞 获得性免疫B细胞辅助性T细胞Th1Th2细胞毒T细胞调节性T细胞 9 淋巴细胞免疫分型T细胞 CD3 CD4 Th Treg CD8 Tc B细胞 CD19 NK细胞 CD3 CD56 10 肿瘤细胞免疫特点 11 Th1Th2细胞因子分泌细胞测定 Th1细胞 介导细胞免疫 细胞毒性T细胞的生长和活化 巨噬细胞的活化 介导迟发型过敏反应 其功能亢进将导致炎症慢性迁延 器官特异性自身免疫病 急性排异反应和接触性皮炎等的发病和免疫病理损伤 Th2细胞 介导体液免疫 促进B细胞的生长 活化和分化 是IgG1和IgE类抗体的转换因子 其功能亢进将导致特异性过敏反应 参与高IgE综合症和嗜酸性粒细胞增多症 12 Th1 Th2漂移与肿瘤免疫 肿瘤可使Th1 Th2平衡向Th2偏移 而Th1 Th2偏移又会促进肿瘤的发展 故探讨Th1 Th2功能状况以判断肿瘤患者的免疫状态可为肿瘤生物治疗提供有效的理论依据 13 CD4 CD25 调节性T细胞 调节性T细胞具有免疫抑制功能 在多种免疫性疾病中起重要的调节作用 成为近年来免疫学领域研究的重要内容 14 许多研究表明 在实体肿瘤和血液恶性肿瘤患者中Treg数目增多 在乳腺癌 卵巢癌 肺癌以及肝癌等多种实体肿瘤患者外周血和肿瘤局部微环境中 Treg比例增高 且数目与患者肿瘤进展程度和预后 生存率呈负相关 血液恶性肿瘤患者中Treg数目呈肿瘤发展阶段相关性增长 但是 Treg增高的机制尚不清楚 去除Treg或封闭其抑制功能 可以增强抗肿瘤免疫反应 15 化疗作为一种重要的治疗肿瘤的方法 对肿瘤患者外周血中的Treg数目可产生一定影响 化疗药物可能通过抑制肿瘤微环境中血管生成 促进Treg凋亡 从而起到有效控制肿瘤的作用 但也有报道证明肿瘤患者接受化疗后 外周血中Treg数目增多 16 化疗究竟对Treg会产生怎样的影响 目前尚无定论 有待于进一步研究 因此 Treg在肿瘤治疗方面的应用成为研究的热点 如何清除或逆转Treg的抑制作用是肿瘤免疫治疗的一个关键问题 17 树突状细胞 DC DC控制体内免疫和耐受的平衡控制T B细胞对可溶性抗原的反应影响产生免疫球蛋白的分类DC亚群分为MDC和PDCMDC诱导免疫应答PDC诱导免疫耐受 18 树突状细胞流式分析 阴性表达抗原设门Lin CD3 14 19 20 56 HLADR组合DC Lin HLADR DC亚群分析骨髓DC CD11c 外周血DC CD123 IL3Ra 阳性表达抗原设门CD85k ILT3 阳性设门仅在单核巨噬细胞及DC细胞表达比HLADR表达更具特异性避免阴性设门DifferentiationofDCsubsets 外周血DC CD123 IL3Ra 骨髓DC CD33 19 ILT3 PE ILT3 PE CD14 CD16 FITC CD33 PC5 CD33 PC5 1 2 3 4 骨髓DC CD14CD16 CD85K ILT3 CD33 20 ILT3 PE ILT3 PE CD14 CD16 FITC CD123 PC5 CD123 PC5 外周血DC CD14CD16 CD85K ILT3 CD123 21 生物免疫治疗CIK细胞 cytokine inducedkiller 是一群以CD3 T细胞为主的异质性细胞群体 包括CD3 CD56 CD3 CD56 及CD3 CD56 三种亚群 主要效应细胞为CD3 CD56 细胞 CIK细胞来源于外周血中的CD4 CD8 及CD4 CD8 T细胞 因其同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子 故兼有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞非MHC限制性杀瘤特点 是目前所知杀伤活性最强的一种免疫效应细胞 22 CIK细胞治疗过程的评价 治疗前病人免疫状况评价 T亚群 NK CIK 细胞因子 是否适合做 能否能培养 值得做CIK 采集MNC MNC数目 纯度 T亚群 NK CIK数目及比例 是否达到培养要求 调节细胞数 MNC数目 T亚群 NK CIK数目及比例 CD3 CD8活化状况 培养 培养是否达标 回输时机 回输后 T亚群 NK CIK 细胞因子 疗效评价 监测 下次治疗的时机 CIK治疗程序 FCM检测项目 意义 23 CIK治疗前患者的免疫功能评价 评价的项目免疫功能六项 CD3 CD4 CD8 CD4 CD8 NK CIKTh1 Th2细胞因子 24 FCM检测的方法免疫功能六项试剂 CD45 CD4 CD8 CD3 CD3 CD56 CD45标本类型 外周抗凝血评价的指标 CD3 CD4 CD8 NK CIK 也可以做绝对计数 25 评价的意义1 CIK治疗的适应症 除外T细胞相关肿瘤 有可见包块2 是否适合做3 能否培养4 值不值得做 26 肿瘤细胞免疫特点 27 采集物评价 培养体系 评价的项目MNC数目 纯度 T亚群 NK CIK数目及比例FCM方法评价评价的意义是否达到培养要求 调节细胞数 28 培养中的监测 评价的项目1 MNC数目 T亚群 NK CIK数目及比例 CD3 CD8活化状况2 培养体系中的细胞因子水平3 CIK细胞质量 坏死 凋亡状况评价方法 FCM评价的意义 培养是否达标 回输时机 29 确定回输时间及培养物是否达到要求 CIK细胞一般在7 9天要求 CD3细胞大于90