实验动物的选择和应用.ppt

1 第一节实验动物的选择原则 一 根据与人相似性的原则选择动物1 选用在整体上与人在结构 功能 及进化程度相似的实验动物灵长类病原微生物的感染谱猕猴的生殖生理生物药品的长期毒性试验2 选用在局部与人的系统 器官结构 功能相似的实验动物犬 猫的血液循环 神经系统猪的皮肤结构 心血管系统蛙的反射弧实验 2 巴马小型猪皮肤和人皮肤的比较A巴马小型猪 B人 3 猴 犬 大鼠与人在药物代谢方面的相似性 4 3 选用群体分布与人相似的实验动物以群体为对象的研究课题 要选择群体基因型 表现型分布与人相似的实验动物 如作药物筛选和毒性试验时 除了应考虑人类与实验动物群体在代谢类型上的差异外 通常以封闭群模拟自然群体基因型 因为封闭群动物既保持其个体基因的杂合状态 又保持其群体基因频率的稳定性 近交系动物由于其基因高度纯合 表型一致 因而对试验刺激也一致 但是对于同一种实验刺激 不同近交系由于其遗传组成不同 因而对实验刺激的敏感性也不同 有的品系高 有的品系低 它不能反映人作为基因杂合状态下对实验刺激的反应 因而一般药物筛选和毒性试验不选用近交系 5 6 4 选用与人类疾病特点相似的实验动物同一种病因 病原对不同动物 包括人 的致病作用各不相同 有的差异很大 而有的却非常相似 要寻找与人类有关疾病相似或接近的自发或诱发性疾病动物模型 选择合适的疾病动物模型进行实验研究 中国地鼠易产生自发性糖尿病自发性高血压大鼠 SHR 选用遗传工程动物疾病动物模型的注意点由于人类的许多疾病是多基因遗传 而目前基因修饰技术仅是增加或敲除1个基因 其表型只是部分模拟和类似于人某些疾病的临床表现和病理改变 另外 一个基因产物在体内不同器官的表达会产生不同的生物学效应 增加或敲除1个基因除了产生我们预期的特定疾病的部分临床表现外 还可能产生其它方面的病理改变 这从遗传角度阐明和解释某些疾病的发病机理上有一定的局限性 7 8 二 根据解剖和生理学特点选用实验动物1 选用解剖特点符合实验目的和要求的动物兔的胸腔结构兔的减压神经犬和兔的甲状旁腺大鼠 仓鼠无胆囊2 选用生理特点符合实验目的和要求的动物犬的红绿色盲兔对致热原十分敏感犬和猫对呕吐反应敏感豚鼠易于致敏致敏比较 豚鼠 兔 犬 小鼠 猫 青蛙豚鼠对维生素C缺乏敏感家兔对射线十分敏感 9 3 选用体型和脏器大小符合实验目的和要求的动物动物体型大小决定了脏器的大小 体型小的动物所能获得的血液样品量和脏器量也少 在实验设计时应充分考虑到实验中或实验结束动物处死时所获得的样品数量能否充分满足试验的需要 很多实验之所以选择大鼠而不是小鼠 除有一些要求外 还有一个重要原因是大鼠提供的血液量和脏器标本量能满足一般试验的需要 如在药物代谢动力学研究过程中 要求在给药后不同时间点取血 取血次数多达十几次 如果每次微量采血0 1ml 大鼠也难承受 如果每次需血量2 5ml 必须要用犬进行实验 为临床操作打基础 应选用与临床操作较接近的动物 如模拟人类心脏移植手术操作的动物实验 因为猪的心脏形态大小与人很接近 常选择猪进行实验 做胎儿围产期实验 用孕羊较好 因羊一胎产仔1 2只 且大小体重与人类相似 10 4 选用对某些药物有特殊反应的动物吗啡 犬 兔 猴 大鼠和人应用吗啡后产生中枢抑制 而小鼠和猫则是兴奋作用 降血脂药安妥明 可使家犬下肢瘫痪 而对猴及其它动物不能引起这样的副作用 苯可引起兔白细胞减少及造血器官发育不全 而对犬却引起白细胞增多及脾脏和淋巴结增生 苯胺及其衍生物对犬 猫和豚鼠能引起与人相似的病理变化 产生变性血红蛋白 但对兔则不易产生变性血红蛋白 在鼠则完全不产生 性激素可使犬易发生化脓性子宫内膜炎而死于败血症 11 三 根据标准化的原则选用实验动物野生动物 不易获得年龄 体重一致的一批动物遗传背景不清健康状况有差异机体反应性不一致标准化实验动物具有明确的遗传背景排除细菌 病毒 寄生虫和潜在疾病的影响排除环境因素的影响减少实验误差 提高结果的科学性和准确性能得到国际上的承认 12 四 选用的动物品系应符合实验要求不同品系代表实验动物的不同遗传基因型 因而具有不同的生物学特性 对同一刺激的反应差异很大 在选择时必须注意 内源性激素 A系小鼠的促性腺激素含量比DBA小鼠低1 5倍 外源性激素 C57BL小鼠对肾上腺皮质激素的敏感性比DBA及BALB c小鼠高12倍 酶活性 A系小鼠肝脏的 葡萄糖酸活性只有C3H小鼠的十几分之一 用激素超排卵 C57BL 6j属高排卵品系 而BALB c属低排卵品系 13 物理因素 35日龄DBA 2小鼠对音响刺激非常敏感 闻电铃声后可出现特殊的发作性痉挛 甚至死亡 而C57BL小鼠却根本不会出现这种反应 化学试剂 对相同浓度的氯仿 DBA 2雄性小鼠死亡率为75 DBA 1为51 C3H为32 BALB c为10 病毒感染 DBA 2及C3H小鼠对同一病毒 Newcastle病毒 的反应和DBA 1小鼠完全不同 前者引起肺炎而后者引起脑炎 自发性肿瘤 C57BL 6J BALB c等为低发乳腺癌品系 而C3H乳腺癌发病率高达97 C3H雌鼠乳腺癌自发率达90 AKR小鼠白血病自发率达65 14 五 选用的动物年龄和体重应符合实验要求选择 常用实验动物的寿命 15 与人性成熟期相对应的动物年龄 16 ICR小鼠 SD大鼠 生长曲线的应用价值 根据年龄判断体重 或根据体重判断年龄 根据生长曲线 选择购买适合实验需要的动物 根据生长曲线 判断实验刺激对动物生长发育的影响 性成熟前后生长发育最快 而体成熟后生长发育趋缓 因此用性成熟前后动物做实验 如实验因素对动物生长发育有影响 就能很快反映出来 17 应根据实验目的来选择适龄动物一般实验采用性成熟前后生长发育期的成年动物成年实验动物体重一般为 小鼠 18 22g 大鼠 180 220g 豚鼠 350 650g 兔 2 2 5kg 猫 1 5 2 5kg 犬 6 10kg长期试验选用幼龄动物小鼠 15 18g 大鼠 80 100g 豚鼠 150 200g 兔 1 5 1 8kg 猫 1 0 1 5kg 犬 6 8kg 老龄动物除了用作老年医学研究外 其他学科很少应用 18 注意事项根据年龄判断体重或根据体重判断年龄要注意品种品系的不同同批动物的年龄 体重尽可能一致 相差不应超过10 在选择动物时 必须了解所选动物的寿命 怀孕期 哺乳期等一些指标 这些指标对保证研究工作的顺利进行及试验结果的分析是非常有用的 19 六 选用的动物性别应符合实验要求 在实验研究中如无特殊要求 一般宜选用雌雄各半 以避免由性别差异造成的误差 20 七 选用的动物生理状态应符合实验要求动物的特殊生理状态如怀孕 哺乳等对实验结果影响很大 如非专门研究妊娠 哺乳等实验 应去除特殊生理状态的动物 以减少结果的个体差异 健康动物对刺激的耐受性较患病动物高 外购的实验动物 应适应性饲养 观察检疫3 7天 证实其身体健康后才开始实验 饥饿 衰竭 寒冷 炎热情况下 动物实验结果不稳定 应加强饲养管理 控制环境条件 21 八 动物的易获得性及动物成本 饲养成本的综合考虑根据科研经费的预算 在宏观上估计不会影响实验结果的前提下 选择最易获得 最经济 最易饲养管理的实验动物进行实验研究 开题前应做好调查 以免在准备实施计划时 才发现无法获得所需实验动物 而十分尴尬 动物的体型大小 从动物身上获取的实验材料要满足试验的要求 22 值得注意的是 在实验设计中 如何科学地选择实验动物应从多方面考虑 在结合上述选择原则和实际科研经费预算基础上 还应结合课题组实验室硬件和软件等条件综合考虑 权衡利弊 充分预计选择的实验动物对实验结果的影响 23 第二节实验动物在药理学研究中的应用 药理学包括药效学 一般药理学和药物代谢动力学等 除了小部分药效学研究可用体外或离体动物实验外 一般药效学和药物代谢动力学研究离不开整体动物实验研究 大部分药效学研究要使用动物模型选择何种动物 应参考上述的实验动物选择原则和实验的具体要求进行 如对动物进行长时间多次采样 则用小动物是不合适的 为了观察不同种属动物对药物的反应性 最好同时选用两种以上动物 24 一 神经系统的药物研究作用于神经系统的药物研究一般使用健康成年的小鼠和大鼠 除非特定需要 一般不选用幼鼠或老年鼠 镇痛药研究 小鼠 大鼠 兔解热药研究 兔3 神经功能药研究 猫 25 二 心血管系统的药物研究抗心肌缺血和心率失常药物研究 犬 猫 兔 豚鼠降压药物研究 犬 猫 大鼠3 治疗心功能不全药物研究 犬 猫 豚鼠4 降血脂药物研究 大鼠 兔5 抗动脉粥样硬化药物研究 兔 鹌鹑6 调心功能药物研究 青蛙 蟾蜍 26 三 呼吸系统的药物研究1 镇咳药物研究 豚鼠 犬 猫2 支气管扩张药物研究 豚鼠3 祛痰药研究 雄性小鼠 兔或猫四 消化系统的药物研究1 胃肠解痉药物研究 大鼠 豚鼠 兔 犬2 催吐或止吐药物研究 猫 犬 鸽等 27 五 泌尿系统的药物研究六 内分泌系统的药物研究七 血液系统的药物研究八 精神药物研究九 计划生育药物研究 28 药物安全性评价是新药在上市前所必须做的一项研究 用以了解药物对各系统 器官脏器的毒性作用单次给药毒性试验多次给药毒性试验安全性药理试验遗传毒性试验生殖毒性试验免疫原性试验致癌试验毒代动力学试验 第三节实验动物在药物安全性评价中的应用 29 一 急性毒性试验急性毒性试验是通过单次或短时间内多次给药 了解动物所产生的毒性反应及其严重程度 为临床安全用药及监测提供参考 急性毒性试验一般用啮齿类小鼠 一般选用昆明种 ICR或NIH等封闭群 雌雄各半 体重18 22g 约4 5周龄 同批动物体重相差不超过4g 分为4 6个剂量组 各剂量组组距以0 65 0 85为宜 申报一类新药至少必须用两种动物 除了啮齿类动物外 非啮齿类最好用比格犬 犬用成年犬 体重8 10kg 30 二 长期毒性试验长期毒性试验是通过连续反复多次给药 观察动物出现的毒性反应 剂量与毒性的关系 主要靶器官是什么 毒性反应的性质和程度以及毒性反应是否可逆等 长期毒性试验要求用两种动物 啮齿类首选大鼠 非啮齿类动物当供试品为化学品时首选比格犬 当供试品为生物药品时 要用猴 大鼠可选用SD或Wistar大鼠 体重要求180 220g 约6 8周龄 体重差异应不超过平均体重的20 试验周期在3个月以上 可选用120 160g 约5 6周龄 每组雌雄各半 比格犬一般用6 12月龄 试验前适应观察2周 必要时需要接种疫苗和驱除肠虫 猴子采用成年猴 3 5岁 3 5 6 5kg 试验前适应观察1个月 必要时需要接种疫苗和驱除肠虫 31 一般设定3个剂量组 低剂量组目的是寻找动物安全剂量范围 为临床剂量设计作参考 此剂量下应不出现毒性反应 高剂量组目的是为寻找毒性靶器官 毒性反应症状及抢救措施提供依据 也为临床毒性及不良反应监测提供参考 应使动物产生明显的或严重的毒性反应 或个别动物死亡 中剂量组应使动物产生轻微的或中度的毒性反应 32 三 皮肤给药毒性试验皮肤给药毒性试验包括皮肤给药急性试验 皮肤给药长期毒性试验 皮肤刺激实验 皮肤过敏试验 采用的实验动物为兔 豚鼠和大鼠 首选兔 体重要求兔2kg左右 豚鼠300g 大鼠200g 雌雄各半 给药前24小时将动物背部脊柱两侧被毛脱去 脱毛范围约相当于体表面积的10 兔约150cm2 豚鼠 大鼠约40cm2左右 一般一侧脱毛区为给药区 一侧脱毛区为赋形剂区 33 第四节实验动物在免疫学研究中的应用 一 免疫学研究在抗感染免疫 免疫生物学研究中应用最广的是BALB c小鼠和各种免疫缺陷动物自身免疫性疾病和系统性红斑狼疮研究 新西兰黑 NZB 以及新西兰黑和新西兰白的杂交F1代 NZB NZWF1 小鼠动物模型 变态反应研究 豚鼠移植免疫研究 小鼠H 2型同类系 二个相同H 2型品系小鼠间移植 可不发生排斥反应 二 免疫学应用1 单克隆抗体的制备 BALB c2 免疫血清的制备 兔 羊3 提供补体 豚鼠 34 第五节实验动物在实验肿瘤学研究中的应用 一 自发性肿瘤模型在自发性肿瘤动物模型中 利用小鼠生长快 生命周期短 近交品系多 自发性肿瘤与人类肿瘤发病相似等特点 可以选用具有不同的遗传性状特点的近交系动物进行肿瘤遗传学和肿瘤病因学研究 缺点 不易同时获得大批病程相似的自发性肿瘤动物 又因这种肿瘤生长较慢 实验周期相对较长 所以一般很少用于筛药 二 诱发性肿瘤模型用化学致癌物 射线或病毒均可在各类动物中诱发不同类型的肿瘤 如用强化学致癌物二甲基苯蒽 DMBA 和甲基胆蒽可诱发乳癌 二苯苄芘诱发纤维肉瘤 二乙基硝胺 DEN 诱发大鼠肝癌 黄曲霉素诱发大鼠肝癌等 35 在使用化学剂致癌时 要注意各类化学致癌剂对动物致癌的特点芳香胺及偶氮染料 通常需要长期 大量给药才能致癌 肿瘤多发生于远离作用部位的脏器如膀胱 肝等 有明显的种属差异 其本身不是直接致癌物 致癌是由于其某种代谢产物的作用 其致癌作用往往受营养或激素的影响 亚硝胺类 致癌性强 小剂量一次给药即可致癌 对多种动物的许多器官能致癌 甚至可以通过胎盘致癌 具有不同结构的亚硝胺有明显的器官亲和性 黄曲霉毒素 已知致癌剂中最强的一种 很小剂量 1mg kg体重 即可使犬 幼龄大鼠 火鸡或小鸭致死 其致癌性也极强 36 三 移植肿瘤模型移植肿瘤模型主要利用裸小鼠 裸大鼠及Scid小鼠 将人体肿瘤移植于免疫缺陷动物因能保持其生物学特性 用于研究人体肿瘤对药物的敏感性 常用的人癌组织移植的途径皮下移植 腹腔移植 原位移植肾囊膜下移植 B 37 第六节实验动物在遗传学研究中的应用 在遗传学上用来研究阐明正常遗传及遗传性疾病机理的动物称为模式动物 目前在遗传学研究上公认的模式动物有果蝇 线虫 斑马鱼和小鼠等 为什么可使用生物进化级别较低的动物来研究遗传学 这是因为生物体由低等向高等 由简单向复杂的进化过程中 很多生物学现象是非常保守的 低等生物的生命现象及分子基础与高等生物相似 因此利用位于生物复杂性阶梯较低级位置上的物种来研究发育共通规律是可能的 因为这些生物的细胞数量更少 分布相对单一 变化也较好观察 而对这些生物的研究有助于人们理解生命世界的一般规律 38 果蝇 成虫体小 长仅3 4毫米 身体淡黄色 复眼多为红色 成虫喜在多种腐烂水果和发酵物周围飞舞和产卵 生活周期较短 约2周 染色体数量少 遗传背景清楚 基因定位与表型效应的关系明确 各种遗传分析方法也较成熟 是一种经典的模式动物 果蝇 39 线虫 成体长仅1mm 全身透明 以细菌为食 居住在土壤中 全身共有959个细胞 性别为雌雄同体或雄性 整个的生命周期仅3天 由一个受精卵发育成为成熟的成体只要二天多一点 25 时需52小时 线虫的细胞分化谱系明确 为研究细胞 细胞间相互作用和特定细胞功能提供了很好的模型 线虫 40 斑马鱼 体长4 6厘米 体呈纺锤形 背部橄榄色 体侧从鳃盖后直伸到尾末有数条银蓝色纵纹 臀鳍部也有与体色相似的纵纹 尾鳍长而呈叉形 雄鱼柠檬色纵纹 雌鱼的蓝色纵纹加银灰色纵纹 斑马鱼通体透明 它具有体外受精 胚胎透明 体外发育 胚胎早期发育快和易于大量获得样品等独有的特点 是研究器官发生的最佳材料之一 斑马鱼 41 第七节实验动物在病毒学研究中的应用 实验动物在病毒学研究中的应用病因未明病原体的分离确认发病机制的研究抗病毒药物筛选疫苗效果鉴定诊断试剂制备 病毒性疾病的研究需要对病毒敏感的动物模型 没有合适的动物模型甚至成为阻碍该病研究的瓶颈 不同种属动物对同一病毒的易感性不同 选用作病毒学研究的实验动物 应首先考虑采用该病毒的易感动物 实验中 应在相应等级的生物安全实验室内进行 应注意了解这些动物的自然感染情况 避免自然感染对实验感染结果的干扰 病毒学研究常选用的实验动物有小白鼠 金黄地鼠 豚鼠 兔 绵羊 禽类 猴等 42 43 一 流感病毒