玉米花色苷含量相关性状和铁(Fe)、锌(Zn)含量相关性状的QTL初步定位及玉米籽粒花色苷含量两个主效QTLAC6和AC10的精_细定位和上位性研究毕业论文.doc

单位代码 学 号 博士学位论文玉米花色苷含量相关性状和铁 (Fe)、锌 (Zn)含量相关性状的QTL初步定位及玉米籽粒花色苷含量两个主效QTLAC6和AC10的精细定位和上位性研究论文作者：覃鸿妮指导教师：蔡一林学科专业：作物遗传育种研究方向：玉米分子育种提交论文日期：论文答辩日期：学位授予单位：中 国 重 庆2012年3月Dissertation for Doctors Degree of Southwest UniversityQTL analysis of anthocyanin-related traits and Fe and Zn concentration-associated traitsand fine mapping and analyzing epistatic gene effects of two genes AC6 and AC10 that controls anthocyanin content in maize(zea mays L)kernelDoctors degree candidate: Supervisor: Prof. :Major: Direction: ChongqingChinaMarch, 2012独创性声明学位论文题目： 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。学位论文作者： 签字日期： 年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院（筹）可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：不保密，保密期限至 年 月止） 。学位论文作者签名： 导师签名：签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日95目 录摘 要IABSTRACTV第一章 文献综述11.1数量性状基因座（QTL）定位11.1.1QTL 主要作图方法11.1.2QTL 定位方法最新进展21.2玉米基因组学研究41.2.1结构基因组学41.2.2比较基因组学51.2.3功能基因组学61.2.4生物信息学61.3花色苷研究进展71.3.1花色苷结构和代谢途径71.3.2花色苷生理功能81.3.3控制花色苷合成的结构基因和调节基因91.4植物体内矿质元素的代谢平衡101.4.1植物对矿质元素耐受能力的研究进展101.4.2作物铁 (Fe) 和锌 (Zn) 生物强化研究进展12第二章 引言132.1研究目的与意义132.2技术路线14第三章 玉米中色素及矿质元素相关性状的QTL定位153.1材料与方法153.1.1试验材料153.1.2试验方法163.2结果与分析213.2.1表型分析213.2.2遗传连锁图谱构建323.2.3QTL定位383.3讨论543.3.1不同环境（重庆和云南）检测到的QTL比较543.3.2不同群体（MuS和MoS）检测到的QTL比较553.3.3QTL的成簇分布及与前人QTL定位研究结果的比较57第四章 玉米籽粒中花色苷含量主效QTL-AP6的精细定位及候选基因预测594.1材料与方法594.1.1试验材料594.1.2试验方法594.2结果与分析614.2.1AC6近等基因系的构建614.2.2AC6 BC4F2分离群体的表型鉴定624.2.3目标QTL区段连锁图谱构建634.2.4AC6的遗传效应分析644.2.5AC6区段标记开发及其精细定位654.2.6候选基因的预测684.3讨论694.3.1QTL标记辅助选择对近等基因系构建的有效性694.3.2近等基因系BC4F2分离群体与F2:3定位结果的比较704.3.3AC6精细定位效果70第五章 玉米叶脉、叶耳颜色主效QTL-AP10近等基因系的构建及进一步定位735.1材料与方法735.1.1试验材料735.1.2试验方法735.2结果与分析745.2.1AC10近等基因系的构建745.2.2AC10 BC4F2分离群体的表型鉴定755.2.3AC10区段标记开发765.2.4目标QTL区段连锁图谱构建765.2.5AC10的遗传效应分析765.3讨论77第六章 玉米籽粒花色苷含量两个显性基因AC6和AC10的互作效应分析796.1材料与方法796.1.1试验材料796.1.2试验方法796.2结果与分析806.2.1BC4F2基因型和表型分析806.2.2AC6和AC10的加性、显性及上位性效应估算826.3讨论83第七章 主要结论和主要创新点857.1主要结论857.1.1玉米花色苷含量和Fe、Zn含量相关性状的QTL初步定位857.1.2玉米籽粒中花色苷含量主效QTLAC6的精细定位和候选基因预测857.1.3玉米籽粒中的花色苷含量主效QTL AC10的验证和进一步准确定位867.1.4AC6和AC10的上位性互作研究867.2主要创新点867.2.1玉米籽粒花色苷含量目标基因的创新867.2.2玉米籽粒和穗轴中Fe、Zn含量的QTL定位87参考文献89致谢91发表论文及参加课题一览表93摘要玉米花色苷含量相关性状和铁 (Fe)、锌 (Zn)含量相关性状的QTL初步定位及玉米籽粒花色苷含量两个主效QTL AC6和AC10的精细定位和上位性研究摘 要玉米是世界上分布最广的作物，也是我国种植面积最大的粮食作物。随着生活水平的不断提高和饮食结构的调整，人们对玉米的营养品质要求越来越高。其功能性品质作为重要的营养品质之一，对防治疾病、增进人体健康起着非常重要的作用，是开发天然保健食品的重要原料，同时也广泛应用于医药、化妆品等行业中。黑（紫）玉米中富含的花色苷和微量元素对机体具有多种生理生化功能。因此，黑玉米是研究花色苷和Fe、Zn等矿质元素代谢的良好材料。认识花色苷合成和矿质元素平衡的遗传规律，可以为我国玉米的功能性品质在天然保健食品及在医药、化妆品等领域中的应用提供新的参考和借鉴。西南大学玉米研究所新创了一个新的特异的黑玉米材料SDM (super dark maize)，本研究利用SDM为共同父本，分别与白玉米自交系木6和黄玉米自交系Mo17杂交，构建两套相关F2:3群体（MuS-F2:3和MoS-F2:3），在重庆歇马和云南元江两个环境中种植F2:3家系，分别对玉米中的15个花色苷含量相关性状及玉米籽粒和穗轴中Fe、Zn含量4个性状进行了初步QTL分析。并在此基础上利用高世代回交群体（BC4F2）对玉米籽粒中的花色苷含量主效基因之一AC6进行了精细定位，对另一个主效基因AC10也进行了验证和进一步准确定位，并对这两个主效基因的上位性互作进行了初步分析。以期为玉米中花色苷和Fe、Zn含量的相关研究提供新的参考与借鉴，为高花色苷和Fe、Zn含量玉米资源的鉴定及基因工程奠定理论基础，为高花色苷含量和Fe、Zn含量分子标记辅助选择和育种改良提供依据。主要研究结果如下：1、 亲本及杂交后代的花色苷含量相关性状的表型特征共同父本SDM的籽粒、穗轴、叶耳、叶脉、叶鞘、花药、花药护颖等七个部位的颜色均表现为紫色，Mo17和木6表现为普通玉米常见的非紫色。SDM籽粒和穗轴中的花色苷含量、黑色素含量、总酚含量均极显著高于Mo17和木6，类黄酮含量SDM与Mo17和木6差异均不显著。两个相关F2:3群体的表型表现一致：均表现为连续分布，但不完全符合严格的正态分布，偏度和峰度均较大，说明花色苷含量相关性状均为数量性状，且受主效基因控制。所有花色苷含量相关性状的遗传力均高于75%。两个群体表型相关性分析结果高度一致，色素相关性状彼此之间存在较大的正相关。2、 亲本及杂交后代籽粒和穗轴Fe、Zn含量的表型特征SDM籽粒和穗轴中的Fe和Zn含量与Mo17和木6存在极显著差异，SDM籽粒中的Zn含量极显著高于木6，穗轴中的Zn含量以及籽粒和穗轴中的Fe含量均极显著低于木6；SDM籽粒和穗轴中的Zn含量以及籽粒中的Fe含量均极显著高于Mo17，穗轴中的Fe含量极显著低于Mo17。两个群体F2:3家系的表型表现一致：均表现为连续分布，但是偏度和峰度偏高，不是典型的正态分布。相对于色素相关性状，籽粒和穗轴中Zn和Fe含量的遗传力较低，尤其是籽粒中Fe含量的遗传力低于60%，其他三个性状的遗传力大于70%。矿质元素相关性状彼此之间存在一定的相关性，籽粒中的Fe和籽粒中的Zn以及穗轴中的Fe和穗轴中的Zn显著正相关，籽粒中的Fe和穗轴中的Fe以及籽粒中的Zn和穗轴中的Zn不相关。3、 F2群体连锁图谱的构建MuS群体构建了含160个标记位点的玉米基因组的13个连锁群,总的遗传距离为1,298.067 cM, 标记间的平均距离为8.11 cM。每条染色体包含有1124个SSR标记, 平均为16个；MoS群体,构建了含170个标记位点的玉米基因组的12个连锁群,连锁群全长1,104.92 cM, 标记间平均距离为6.46 cM。每条染色体包括1022个SSR标记, 平均为17个。4、 玉米花色苷含量相关性状的QTL定位两个群体分别检测到65个和73个与花色苷含量相关的QTL，分布在除了第5染色体外的9条玉米染色体上。MuS中，8个染色体区段存在环境顿感QTL（即在该区域中存在的QTL在不同环境中均能被检测到），位于第1、6、7、9、10染色体上；MoS中，10个染色体区段存在环境顿感QTL，位于第1、4、6、7、10染色体上。两个群体共检测到5个花色苷含量“一致性QTL”，位于bin1.04, bin4.06, bin6.04, bin7.04和bin10.04。控制不同性状的QTL有成簇分布的现象，主要表现在第6和第10染色体，bin6.04和bin10.04区域内几乎包含控制所有花色苷含量相关性状的QTL，且大多数QTL对表型的贡献率大于10%，因此认为这两个染色体区段存在控制花色苷含量相关性状的主效基因。5、 玉米籽粒和穗轴中Fe、Zn含量的QTL定位共检测到32个与籽粒和穗轴中Fe、Zn含量相关的QTL，重庆和云南两个环境中分别检测到17个和15个。在MuS和MoS中分别发现3个和4个染色体区域存在环境钝感QTL，位于第2、7、9、10染色体上。两个群体检测到的QTL在标准图谱（IBM2 2008 Neighbors Frame6）上进行整合，结果表明位于第2、7、9三条染色体上的QTL在两个群体中均能检测到，而且位置和效应高度一致。位于这三条染色体上的控制不同性状的QTL有成簇分布的现象，主要表现在第2染色体上检测到的QTL同时与ZnK, ZnC, FeK 和FeC有关，第9染色体上检测到的QTL同时与Znk, FeK和FeC有关，第7染色体上检测到的QTL同时与ZnK和ZnC有关，成簇分布的QTL可能是紧密连锁也可能是一因多效的同一QTL，从遗传学的层面解释了不同性状间表型的相关性。6、 玉米籽粒中的花色苷含量主效基因AC6的精细定位及候选基因预测在MuS-BC4F2和MoS-BC4F2中，分别用6对和7对多态性SSR标记构建了目标QTL区段的遗传连锁图谱，结合籽粒中的花色苷含量，对第6染色体上控制玉米籽粒花色苷含量的主效QTL（命名为AC6）进行了验证，两个群体中分别将其进一步定位到了标记区间umc1857-umc1014和umc1979-umc1014。在该区段内自行设计SSR标记，将AC6精细定位在了SSR标记S8和umc1014之间，这两个标记位于bin6.04区的ctg280上，两者之间物理距离518Kb。该区间的相应位置存在一个Z576C20.2（PL transcription factor）血红素加氧酶基因，参与玉米色素调节。为了确定Z576C20.2是否是候选基因，设计了1对引物对BC4F2世代中目的性状对应的极端株系（目标表型与SDM最一致的株系视为目标性状的“突变体”（SDMm），与木6或Mo17性状一致的视为“野生型”（SDMw）的Z576C20.2基因进行扩增、测序。测序结果发现，该基因的碱基序列未发生任何变化。推测该突变性状可能是由其它基因发生突变或者是由该基因启动子序列发生突变造成。7、 玉米籽粒中的花色苷含量主效基因AC10的验证和进一步准确定位在MuS-BC4F2群体中，加大标记密度，构建了包含7对SSR标记的目标区段遗传连锁图谱，结合基因型和表型，对第10染色体上的另一个与玉米籽粒中花色苷含量相关的主效QTL（命名为AC10）进行了进一步定位。叶脉颜色检测到了两个QTL位点，分别位于标记区间IDP7852-IIDP8526和S44-bnlg1028内，叶耳颜色检测到了一个QTL，位于区间S44-bnlg1028内。籽粒花色苷含量没有检测到QTL，可见第10染色体上的基因不能单独控制玉米籽粒花色苷的含量。目的基因所在染色体区段内，很难找到亲本多态性标记。因此，要想在此基础上对AC10开展进一步的精细定位，找到足够的多态性标记是关键。8、 AC6和AC10的上位性互作研究通过对BC4F2双片段聚合系基因型和表型的分析，以及对两个基因加性、显性和上位性的估算结果，表明AC6和AC10单座位QTL的加性效应和显性效应都较小，AC6单座位的加性效应和显性效应相对较大。AC10单独存在时对增大玉米籽粒中的花色苷含量没有显著作用。当AC6和AC10同时存在时，两个基因会发生互作，使得玉米籽粒中的花色苷含量大大提高。关键词：玉米；花色苷含量；铁（Fe）含量；锌（Zn）含量；QTL初步定位；QTL精细定位；上位性分析AbstractQTL analysis of anthocyanin-related traits and Fe and Zn concentration-associated traitsand fine mapping and analyzing epistatic gene effects of two genes AC6 and AC10 that controls anthocyanin content in maize(zea mays L)kernelPh.D. Candidate:HongniQinSupervisor: Prof. YilinCaiAbstractMaize(zea mays L) is an important kind of grain crop which covers the biggest area in China with widest distribution in the world. With living standars improvement and diet adjustments, pople have more and more demands on nutrient quality of maize. The functional quality of maize plays a significant rule to prevent diseases and promote the health of human body. Black (purple) maize is a good source of anthocyanins and microelements, which could be regarded as an excellent material for genetic and metabolic research of anthocyanin, iron and zinc. Exploration of intrinsic genetic law on molecular level for biosynthesis of anthocyanin and homeostasis of microelement could provide references and useful guidance for black maize future applications in medicine, cosmetics and other fields.A newly black-maize inbred line SDM (Super Dark Maize) bred by Maize Research Institute of Southwest Univercity was used as a common male parent to cross with Mu6 (white kernel) and Mo17 (yellow kernel) respectively. Four datasets from two F2:3 populations (MuS-F2:3 and MoS-F2:3) and two environments (Chongqing and Yunnan) were used to analyze the QTLs for 15 anthocyanin-related traits and 4 Fe and Zn conventration-sssociated traits.Fine mapping and analyzing epistatic gene effects of two genens AC6 and AC10 that controls anthocyanin content in maize kernel was conducted based on the preliminary QTL mapping. We expect providing basis and useful guidance for further study of biosynthesis of anthocyanin and homeostasis of microelement. The main results were as follows: 1. Phenotype performance of anthocyanin-related traits for F2:3 families and their parentsThe colors of kernel, cob, auricle, leaf vein, leaf sheath, anther and anther-cape of male parent SDM were all daker (dark purple) than female parents Mu6 and Mo17, and the anthocyanin, melanin, total phenolic contents of SDM kernel and cob were also statistically higher than Mu6 and Mo17. There were no significant difference in flavonoid content between SDM and Mu6/Mo17. All traits of F2:3 families continuously segregated but not normally distributed with higer kurtosis and skewness, which indicated that all traits were quantitative trait loci (QTL) controlled by combination with multiple-gene and maior gene. The heritabilities of all traits were more than 0.75. In both F2:3 populations, most of traits had significant positive correlation to each other.2. Phenotype performance of Fe, Zn concentraition-related traits for F2:3 families and their parentsThere were highly significant differences between two parents in ZnK, FeK, ZnC and FeC in two populations. In MuS population, ZnK of SDM was highly significantly higher than Mu6, whereas ZnC, FeK, FeC of SDM were highly significantly lower than Mu6. In MoS population, ZnK, ZnC and FeK of SDM were highly significantly higher than Mo17, whereas FeC of SDM was highly significantly lower than Mo17. The frequency distributions of the four traits showed continuous phenotypic variation, but all four traits were not normally distributed. The heritability of FeK (0.6) was lower than the heritability of other three traits (0.7). There existed significant or highly significant positive correlations between ZnK and FeK, ZnC and FeC, whereas ZnK and FeK did not significantly correlate to ZnC and FeC.3. Linkage map construction for the two F2 populationsFor MuS population, 160 polymorphism markers were used to develop the genetic map. These SSR loci were mapped on 13 linkage groups covering 1,298.067 cM of the whole genome with an average interval of 8.11 cM between adjacent markers. The average number of markers per chromosome was 16 ranged from 11 in chromosome 7 to 24 in chromosome. For MoS population, 171 polymorphism markers were used to construct the genetic map. These SSR loci were placed on 12 linkage groups representing the 10 maize chromosomes. The genetic map spanned 1,104.92 cM in length with an average interval of 6.46 cM between adjacent markers. The number of markers ranged from 10 in chromosome 7 to 22 in chromosome 1 with the average number of 17 markers per chromosome. 4. QTL mapping for anthocyanin-related traitsTotally 65 and 73 QTLs were detected for MuS-F2:3 and MoS-F2:3, redpectively, which were distributed on chromosome 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9 and 10. It was found that eight and ten QTLs detected in different environments for the two populations respectively, were located in the same genetic regions, and these stable QTLs were distributed on chromosome 1, 4, 6, 7, 9 and 10. Through the comparison of the two populationsresults, five congruent QTLs were identified for anthocyanin-related traits in bin1.04, bin4.06, bin6.04, bin7.04 and bin10.04 respectively. Furthermore, the distribution of QTLs for these traits showed a high concentration of QTLs in few chromosome regions. A number of QTLs which were located in bin6.04 and bin10.04 were clustered. For most of these QTLs, the contribution rate of phenotypic variation was more than 10%. The two chromosome regions were considered to have major genes mainly controlling anthocyanin-ralated traits.5. QTL mapping for Fe, Zn conventration-related traitsA total of16 and 15 QTLs were identified in CQ and YN respectively, some of which were identical in different environments. The common regions for same trait at different environments were 3 and 5 in MuS-F2:3 and MoS-F2:3 respectively. Compared with the IBM2 2008 Neighbors Frame6, the distribution and effect of some QTLs in two populations were highly consistent and many QTLs on chromosome 2, 7 and 9 were detected in both populations. Moreover, several mineral QTLs co-localized with each other for both populations such as the QTLs for ZnK, ZnC, FeK and FeC on chromosome 2, QTLs for Znk, FeK and FeC on chromosome 9 and QTLs for ZnK and ZnC on chromosome 7, which probably were closely linked to each other, or were the same pleiotropic QTL. The co-localizations may explain the phenotypic correlations among traits.6. Fine mapping of main QTL AC6 that control anthocyanin content of maize kernel and prediction for candidate genesFor BC4F2-MuS and BC4F2-MoS, a total of 6 and 7 polymorphic SSR markers were used to construct linkage map of target region on chromosome 6 (bin 6.04), respectively. A major gene AC6related to anthocyanin content of maize kernel was further located in the interval umc1857-umc1014 and umc1979-umc1014 in BC4F2-MuS and BC4F2-MoS respectively. To fine map the gene AC6, the self-designed primers for the target gene were used and AC6 was mapped between S8 and umc1014with genetic distance 518Kb. In this region, a heme add oxygen enzyme gene Z576C20.2 (pltranscription factor), which is a transcription factor involved in the regulation of maize pigment. The Z576C20.2 of two extreme individuals of BC4F2 (“mutant plant” (SDMm) and “wild plant” (SDMw) were amplified, sequenced and compared. The PCR products electrophoretic patterns and base sequence of SDMm and SDMw were completely concordant. The results showed Z576C20.2 was not the candidate gene of AC6. Perhaps, the high anthocyanin content trait may be controlled by other gene or caused by promoter mutation of Z576C20.2. 7. Further mapping of the other QTL AC10 that control anthocyanin content of maize For BC4F2-MuS, a total of 7 polymorphic SSR markers were used to construct linkage map of target region on chromosome 10 (bin 10.04). Two QTLs related to COV (colur of leaf vein) were further located in the interval IDP7852-IIDP8526 and S44-bnlg1028. One QTL related to COA (colur of leaf auricle) was fuether mapped in the intervalS44-bnlg1028. No QTL related to ACK (anthocyanin content of kernel) was detected. In order to fine mapping the major gene AC10,enoughpolymorphic marker is crucial.8. Epistasis analysis of AC6 and AC10Double segment substitution line (DSSL) of AC6 and AC10 was used to analyze additive, dominant and epistatic effects of the two major QTLs. The additive effect and dominant effect of AC6 was relatively greater than AC10,but the epistatic effects of AC6 and AC10played a major role in anthocyanin content of maize kernel.Key words: maize (zea mays L);anthocyanin content; iron (Fe) concentration; zinc (Zn) concentration; QTL preliminary map; QTL fine map; epistatic effect analyze第一章 文献综述第一章 文献综述1.1 数量性状基因座（QTL）定位1.1.1 QTL 主要作图方法最初对数量性状的研究是基于单标记分析，对性状平均数进行方差分析、t测验、回归分析和最大似然估计（Soller et al., 1976; Weller, 1986; Edwards et al., 1987; Stuber et al.1987; Tanksley et al., 1982; Luo and Kearsey, 1989），以及基于性状分析对标记频率进行差异检验来检验QTL的存在。这种方法的缺陷众所周知，即只有QTL的位置与标记完全重合而且同一个染色体区段最多存在一个QTL的情况下才能准确定位 (Wang, 2009)。随后，1961年出现了“连锁标记”这一新的概念（Thoday, 1961），由于筛选两个连锁标记在当时十分困难使得它的应用受到了极大的限制。随着大量高密度分子连锁图谱的获得，从整个基因组定位数量性状多基因成为可能，由此而产生了区间作图法（Lander and Botstein, 1989），从而建立了QTL定位的基本框架。区间作图法的原理是目标性状对后验概率的回归，而与此类似的回归分析法则是对先验概率的回归（Haley and Knott, 1992; Martinez and Curnow,1992）。如果QTL在标记附近，两种方法结果相似，但是如果QTL不在标记附近，区间作图法的结果则优于回归分析法（Kao, 2000）。区间作图法最大的优点就是可以在全基因组水平上找到QTL并估计其位置和效应，但是如果在同一染色体的相邻区间存在多个连锁的QTL，则QTL的位置和效应的估计会存在偏差。两个紧密连锁的QTL，如果作用方向相反则会因为相互抵消而检测不到，反之，作用方向相同则会出现所谓的“幻影”QTL（Jansen,1999; Broman and Speed, 1999），使得连锁的QTL的贡献率直接相加，其值有可能超过100%的现象。为了克服区间作图法对紧密连锁QTL估计偏差的缺陷，Jansen (1993）和Zeng (1993）分别提出了复合区间作图法，此方法引入其他标记作为协变量来消除“幻影”QTL现象，能更准确的估计同一染色体上多个QTL的位置和效应，但是合适的分子标记密度对直接影响结果的准确度，标记太密会减低QTL的检测功效，标记密度太小又不能很好地控制遗传背景。为此，诞生了多区间作图法（Kao and Zeng, 1997; 1999; 2002），该法是真正意义上的多QTL遗传模型，同时包含多个QTL及其两两互作。随后，多QTL定位有了迅速发展，到目前为止，主要有极大似然法和贝叶斯（Bayesian）法两大类。极大似然法包括多区间作图法和惩罚最大似然法（Zhang and Xu, 2005），Bayesian法包括可逆跳跃MCMC (Markov chain Monte Carlo)法（Green, 1995; Satagopan et al., 1996; Sillanp and Corander, 2002; Sillanpaa and Arjas, 1998; Sillanpaa and Arjas, 1999）和压缩估计法（Xu, 2003; Zhang and Xu, 2004; Zhang and Xu, 2005; Wang et al., 2005）。这些方法都有一定的缺陷，多区间作图法最大的不足是只能检测主效QTL间的互作，效应较小的QTL会出现漏检的情况；可逆跳跃MCMC法主要是检测速度太慢；压缩估计法搜索速度较快，但是运算时间较长；惩罚最大似然法搜索和运算速度有了很大的提高，但是随着标记密度的增大，其参数估计存在一定得困难。可见，QTL定位方法有待进一步的发展，研究者在这方面也在不断地进行研究以获得更为准确的作图方法，王建康等提出了一种新的作图方法即完备区作图方法(Inclusive Composite Interval Mapping，简称ICIM)（wang, 2009），该方法简化了复合区间作图中控制背景遗传变异的过程。1.1.2 QTL 定位方法最新进展1.1.2.1QTL 动态定位传统的QTL定位方法都是针对作物生长过程中某一个时间点的观测值，作为表型值，对目标性状进行静态QTL定位，反映QTL的累积效应(蒋锋等, 2009)。然而，很多数量性状在发育的过程中随时间变化，称为动态性状。动态QTL定位可以检测不同发育时期各个QTL的作用和有关QTL在植物发育过程中的表达情况，动态QTL定位一般有三种方法（Yang et al., 2006; Wu et al., 2002; Zhang, 2006）：一是将不同时间测定的表型值或者表型增值视为同一性状的重复测定值，然后在重复框架下分别对各次测定的表型值依次进行分析，即用常规QTL定位方法分析不同时期的表型，找出不同发育时期可能存在的基因；二是将不同时间点测定的观测值视为不同性状，由多变量方法分析该性状，此方法优于第一种方法，但是如果观测点太多，变量位数和参数个数都会增加，因此该方法只适用于时间点数少的情形；三是将时间点于表型值对应，构建数学模型，然后由多变量方法分析该模型，表型数据量减少，而且模型参数一般具有生物学意义，对性状发育的遗传学基础能研究得更为透彻，不足之处在于对模型参数的估计往往会存在误差。综合看来，此方法为动态QTL定位的最优方法 (蒋锋等, 2009)。1.1.2.2 eQTL定位表达谱是比较两个或多个处理间表达谱的差异，检测与处理有关的基因。将每一个基因的表达谱作为一个性状，然后分析分子标记与表达谱之间的连锁，从而定位得到的QTL成为eQTL（Jansen and Nap, 2001; Gibson and Weir, 2005）。当eQTL的遗传连锁与某基因位置相同时，便可找到与控制该数量性状的基因。eQTL定位是近年来国际上新的研究热点，并在酵母、玉米等中运用（Brew et al., 2002; Schadt et al., 2003），但是由于表达谱构建成本偏高使其应用受到了限制。1.1.2.3QTL精细定位QTL的初步定位只能将QTL定位到一个染色体区段，通常为10-30cM的标记区间（Kearsey and Farquhar, 1998），这么大的区间范围很难确定QTL的具体位置以及该区间内包含的是一个QTL还是几个QTL共同作用，无法确定控制某性状的基因。因此，发展新的方法对QTL进行精细定位试是很有必要的。目前来说，QTL精细定位主要可以从以下三个方面着手：第一，统计方法的合理利用和新的统计方法的开发可以挖掘更多潜在的信息。首先是基于连锁不平衡而提出的关联分析（Bodmer, 1986），该方法不用构建连锁群而且解析度较高，它的精度取决于群体的连锁不平衡结构，在人体复杂疾病的QTL定位中有着举足轻重的地位，但是其在作物中的应用较少。为了克服关联分析假阳性较高的缺点，Pritchard