蛋白质杂交技术.pptVIP

第四节蛋白质杂交技术 检测DNA可用Southern印迹法检测RNA可用Northern印迹法检测蛋白质同样有蛋白质印迹法 Western印迹法 蛋白质印迹是将蛋白质转移到固相支持物上 然后利用抗体与附着于固相支持物上的靶蛋白发生特异性的抗原抗体结合反应 待测样品经过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS PAGE 被转移到固相支持物上 固相支持物以非共价键的形式吸附蛋白质以固相支持物上的蛋白质为抗原 与对应的抗体发生特异性的抗原抗体结合反应与酶或同位素标记的第二抗体发生反应经过底物显色或放射自显影 以检测电泳分离的靶蛋白 一 原理 Western印迹有SDS PAGE的高分辨力固相免疫测定的高特异性和敏感性 可测出1ng 5ng中等大小的蛋白质 由于蛋白质的电泳分离几乎总是在变性的条件下进行 因此 不存在溶解 聚集以及靶蛋白与外来蛋白的共沉淀等问题 还具有简便 标本可长期保存 结果便于比较等优点 一 蛋白提取试剂1 细胞裂解液20mmol LTris pH7 5 150mmol LNaCl1 TritonX 100焦磷酸钠 磷酸甘油 EDTA 正钒酸钠 Na3VO4 亮抑肽素等多种蛋白酶抑制剂 二 试剂 2 蛋白上样缓冲液100mmol LTris Cl pH6 8 200mmol L二硫苏糖醇 DTT 4 SDS 十二烷基硫酸钠 0 2 溴酚蓝20 甘油 二 SDS PAGE试剂1 30 丙烯酰胺溶液丙烯酰胺30g 双丙烯酰胺0 8g 溶于100ml水中 过滤后贮于褐色瓶中低温保存 可用一个月 2 Tris缓冲液 1 1 5mol LTris pH8 8 积层胶缓冲液 Tris碱18 17g 用HCl调pH8 8 加水至100ml 2 1 0mol LTris pH6 8 分离胶缓冲液 Tris碱12 11g 用HCl调pH6 8 加水至100ml 3 10 SDS可用去离子水配成贮存液保存于室温 4 10 过硫酸胺过硫酸胺提供丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基 可用去离子水配制小量的贮存液并保存于4 冰箱中 由于过硫酸胺会缓慢分解 故应隔周重新配制 5 TEMED N N N N 四甲基乙二胺 通过催化过硫酸胺形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合 6 Tris 甘氨酸电泳缓冲液配成10 贮存液备用 在900ml去离子水中溶解30gTris碱和144g甘氨酸 然后加入10gSDS 用HCl调pH至8 3 用去离子水补至1000ml 使用前用去离子水稀释成1 应用液 三 转膜缓冲液39mmol L甘氨酸48mmol LTris碱0 037 SDS20 甲醇 四 染色液与脱色液1 考马斯亮蓝R250染液100mg考马斯亮蓝R250溶于40ml乙醇 加10ml冰醋酸 补水至100ml 2 考马斯亮蓝脱色液40ml乙醇 加10ml冰醋酸 补水至100ml 3 丽春红S贮存液2g丽春红S 30g三氯乙酸 30g磺基水杨酸 加水至100ml 使用时 将1份上述贮存液加9份去离子水即为丽春红S应用液 使用后应废弃 五 封闭液5 脱脂奶粉0 01 防沫剂A0 02 叠氮钠溶于磷酸盐缓冲液 PBS 一 样品前处理细菌一般直接用蛋白上样缓冲液裂解 真核细胞或哺乳动物组织通常加细胞裂解液 机械或超声波室温匀浆0 5min 1min 4 10 000g 13 000g离心5min 取上清按照每4 l蛋白样品加入1 l5 蛋白上样缓冲液的比例混合 100 水浴加热3min 5min 以充分变性蛋白 冷却到室温 上样到SDS PAGE胶加样孔 三 实验方法 原理是根据大多数蛋白质都能与阳离子表面活性剂SDS按重量比结合成复合物使蛋白质复合物所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子所带的负电荷 消除了不同蛋白质分子的电荷效应蛋白质分子的迁移速率完全取决于分子量的大小 从而达到了分离不同分子量大小蛋白质的目的 二 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 胶有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度 经双丙烯酰胺交联后丙烯酰胺凝胶的刚性和抗张强度都有所增加 形成的小孔必须能够允许SDS蛋白复合物通过这些小孔的孔径随双丙烯酰胺 丙烯酰胺比率的增加而变小 比率接近1 20时孔径达到最小值 一般按双丙稀酰胺 丙烯酰胺为1 29配制 表1SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围 1 SDS聚丙烯酰胺凝胶的灌制 1 安装玻璃板 2 确定凝胶溶液体积 按所需丙烯酰胺浓度配制一定体积的分离胶溶液 依次混合各成分 见下表 一旦加入TEMED 马上开始聚合 故应立即快速旋动混合物并进入下步操作 表2积层胶 分离胶所需溶液成分的配比 3 迅速在两板的间隙灌注丙烯酰胺溶液 留出积层胶所需空间 梳子的齿长再加1cm 然后小心的在丙烯酰胺溶液上加一层去离子水 凝胶垂直放置于室温下 4 分离胶聚合完全后 约30min 倾斜倒出覆盖的去离子水 5 配制5 积层胶 6 在已聚合的分离胶上直接灌注积层胶 立即在积层胶溶液中插入干净的梳子 小心避免混入气泡 7 积层胶聚合完全后 约30min 小心移出梳子 将凝胶固定于电泳装置上 上 下槽各加入Tris 甘氨酸电泳缓冲液 必须设法排出凝胶底部两玻璃板之间的气泡 2 上样和电泳取一定量样品与上样缓冲液混合后 加入上样孔 将电泳槽与电源连接 正极应接下槽 凝胶上所加的电压为8伏 cm 当上样缓冲液中的染料前沿进入分离胶后 把电压提高到15伏 cm 继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部 约4h 然后关闭电源 从电泳装置上卸下玻璃板 用刮勺撬开玻璃板 取下凝胶 3 考马斯亮蓝对SDS凝胶进行染色考马斯亮蓝染色的主要目的包括 显示靶蛋白在凝胶中的粗略位置 从而切去不含靶蛋白的凝胶 这样可以节省硝酸纤维素膜 转膜后 凝胶染色可判断蛋白质转膜是否完全 Western印迹的固相支持体有多种 重氮苯硫醚 diazophenylthio DPT 纸重氮苄氧甲基 diazobenzyloxymethyl DBM 纸溴化氰活化纸氰尿酰氯纸活化尼龙膜目前最常用的是硝酸纤维素滤膜 三 蛋白质从凝胶转移至固相支持体 蛋白质从凝胶转移至硝酸纤维素滤膜上 凝胶及与之相贴的硝酸纤维素滤膜夹于事先用转膜缓冲液浸泡过的Whatman3MM滤纸之间然后把结合体夹在石墨电极板之间 硝酸纤维素滤膜朝阳极一侧蛋白质转移可用于室温进行 1 5h 2h便可完成 对硝酸纤维素膜上的蛋白进行染色判断转膜是否完全可供硝酸纤维素滤膜上的蛋白质进行染色的方法有很多种 但只有丽春红S染色法可与免疫学检测方法兼容 这是因为该染料只会短暂显色而且在进行Western印迹时被洗去 1 封闭滤膜的蛋白结合位点 在加入一抗之前 必须封闭可能结合的位点以降低这类非特异性结合的背景 封闭液常用脱脂奶粉将硝酸纤维素滤膜放入自封袋中 根据滤膜面积以0 1ml cm2的量加入封闭液尽可能排除里面的气泡 然后封闭袋口 平放在平缓的摇床平台上室温温育1h 2hPBS漂洗滤膜3次 每次10min 四 抗原抗体反应 2 第一抗体和靶蛋白的结合将抗体以适当的比例稀释室温反应1h 2hPBS漂