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第4章生物传感器关键技术 分子识别元件固定化 本章主要内容基本方法常用的三种经典方法LB膜技术分子自组装 SAM 技术 1 概述 早期的生物活性物质测量法 如酶分析法 是在水溶液状态下进行的 由于酶在水溶液中一般不太稳定 且酶只能和底物作用一次 因此 使用起来很不方便 要使酶作为生物敏感膜使用 必须研究如何将酶固定在各种载体上 称为酶的固定化技术 同常规方法相比 使用限制在电极表面的固定化酶具有很多诱人的特征 1 固定化酶可以很快从反应混合物中分离 并能重复使用 2 通过适当控制固定化酶的微环境 可获得很多所需要的性质 如高稳定性 高灵敏度 快速的响应等 3 在选择电极尺寸和形状方面具有较大的灵活性 易于微型化或采用复杂的表面 如网状玻碳 4 可防止溶液中其它物质的干扰和对电极表面的玷污等 2 生物敏感膜 分子识别元件 的固定化方法是生物传感器制作的关键问题之一 固定化的目的在于使被测物与生物敏感膜反应所产生的信号耦合到换能器上 以便通过换能器转换为易于检测的电信号 生物传感器具有的选择性 特异性 稳定性 高灵敏度和快速响应时间等优异特性都需要依靠一种合适的分子识别元件的固定化方法来实现 也决定着生物传感器是否有研究和应用价值 3 固定化的基本要求 1 保持原有分子识别元件活性 2 尽量减小非特异性吸附 3 固定量大 4 固定牢固 不易脱落 5 均匀 致密 6 不影响换能器的灵敏度和响应时间 4 4 1基本方法 目前 被广泛研究过的固定化技术主要有吸附法 包埋法 交联法 共价键合法等 现对它们介绍如下 以酶为例 5 4 1 1吸附法 分子识别元件在电极表面的物理吸附是一种较为简单的固定化技术 酶在电极上的吸附一般是通过含酶缓冲溶液的挥发进行的 通常温度为4 因此 酶不会发生热降解 吸附后 还可以通过交联法来增加稳定性 物理吸附具有无需化学试剂 极少的活化和清洗步骤 很少发生酶降解 对酶分子活性影响较小等优点 但对溶液的pH值变化 温度 离子强度和电极基底较为敏感 需要对实验条件进行相当程度的优化 该方法由于存在吸附过程的可逆性 生物活性单元易从电极表面脱落 而且同其它固定化技术相比 分子识别元件的寿命较短 因此 在各种生物传感器的研制中 现已很少采用这种方法 固体吸附剂有 活性炭 硅藻土 多孔陶瓷 多孔玻璃等 6 4 1 2物理包埋法 迄今为止 应用最为普遍的固定化技术是采用凝胶 聚合物包埋 它能将酶分子或细胞包埋并固定在高分子聚合物三维空间网状结构中 最为常用的聚合物是聚丙烯酰胺 该技术的特点是 1 可采用温和的试验条件及多种凝胶 聚合物 2 大多数酶可很容易地掺入聚合物膜中 一般不产生化学修饰 3 对酶活性影响较小 4 膜的孔径和几何形状可任意控制 5 包埋的酶不易泄漏 并可采用其它固定化技术如共价键合法和交联法进一步改进包埋的稳定性 6 可固定高浓度的分子识别元件 7 此外 包埋法还具有过程简单 可对多种分子识别元件进行包埋的优点 这种固定技术在某些方面也具有一定的局限 如 必须控制很多试验因素 聚合物形成过程中产生的自由基对生物活性单元可能产生失活作用 聚合物的空间结构使之局限于测定较小尺寸的物质 而且 由于大的扩散排阻使响应时间增加 采用这种固定化技术时 通常采用物理的方法将凝胶 聚合物限制在电极表面 这使得传感器难以微型化 8 包埋法包括基质包埋法和微胶囊包埋法两种 微型胶囊包埋法 基质包埋法 9 4 1 3交联法 通过采用双功能团试剂 在分子识别元件之间 分子识别元件与凝胶 聚合物之间交联形成网状结构而使分子识别元件固定化的方法称为交联法 最常用的交联试剂为戊二醛 能在温和的条件下与蛋白质的自由氨基反应 其原理反应式如下 双功能试剂 戊二醛 需要固定的生物敏感膜 蛋白质 传感器 表面带 NH2 经过固定化处理后的传感器 表面固定上了生物敏感膜 酶 10 采用交联法的局限是膜的形成条件不易确定 需要仔细地控制pH值 离子强度 温度及反应时间 酶膜的厚度及戊二醛的浓度对传感器的响应具有重要影响 1 当酶膜较厚时 由于扩散受到阻碍 致使响应信号下降 响应时间延长 2 戊二醛的浓度较低时 对固定化酶的失活作用较弱 但固定化酶的量也少 而戊二醛的浓度较高时 酶的固定量虽然增大 但对固定化酶的失活作用也大 3 同时 双功能团试剂也可能不是选择性的 既可能发生分子间键合又可能发生分子内键合 交联法分为酶交联法 辅助蛋白交联法 吸附交联法 载体交联法 11 此法借助双功能试剂 bifunctionalagents 使蛋白质结合到惰性载体或蛋白质分子彼此交联成网状结构 双功能试剂具有两个功能基团 能与蛋白质中赖氨酸的 氨基 N端的 氨基 酪氨酸的酚基或半胱氨酸的巯基发生共价交联 可供交联的双功能试剂见表3 5 这些交联试剂都含有两个相同的活性基团 因此又称为同质交联试剂 其中以戊二醛最经常使用 戊二醛能与蛋白质分子中的游离氨基形成Schiff碱而发生交联 戊二醛与蛋白质的反应 戊二醛 蛋白质 关于双功能试剂 12 13 4 1 4共价键合法 将生物分子识别元件通过共价键与电极表面结合而固定的方法称为共价键合法 通常要求在低温 0 低离子强度和生理pH条件下进行 并加入酶的底物以防止酶的活性部位与电极表面发生键合作用而失活 当共价键在生物分子的非活性部位键合时 被固定的分子仍能保持较高的活力 电极表面的共价键合比吸附困难 但固定化酶稳定性较好 因此应用广泛 共价键 14 当向电极表面共价键合酶等生物分子识别元件时 需考虑很多因素 键合过程通常包括三个步骤 基底表面的活化 酶的偶联 除去键合疏松的酶 这些步骤中每一步合适的试验条件都取决于生物分子识别元件及偶联剂的特性 下面简单介绍几种常用的基底表面活化方法 15 基底表面活化的方法 1 重氮法2 迭氮法3 溴化氰法4 烷基化法 16 重氮法 将含有苯氨基的不溶性载体与亚硝酸反应生成重氮盐衍生物 使基底表面引进活泼的重氮基团 苯氨基 17 18 迭氮法 含有酰肼基团的基底表面可用亚硝酸活化 生成迭氮化合物 19 溴化氰法 含有羟基的基底表面 如纤维素等 可用溴化氰活化生成亚氨基碳酸衍生物 20 烷基化法 含羟基的基底表面可用三氯 均三嗪等多卤代物进行活化 形成含有卤素基团的活化基底表面 21 4 2常用的三种经典方法 硅烷化固定法PEI固定法SPA固定法 又称蛋白A法 22 4 2 1硅烷化固定法 硅烷偶联剂最早是于本世纪40年代由美国联合碳化物公司 UCC 和道康宁公司 DCC 首先为发展玻璃纤维增强塑料而开发的 最初把它作为玻璃纤维的表面处理剂而用在玻璃纤维增强塑料中 硅烷偶联剂是继有机硅工业中三大产品 硅油 硅橡胶 硅树脂之后的第四大部类 在有机硅工业中的地位日趋重要 已成为现代有机硅工业 有机高分子工业 复合材料工业及相关高技术领域中不可缺少的配套化学助剂 而且是一种重要的高科技含量 高附加值的有机硅产品 23 硅烷化固定法是一种比较成熟 应用较多的固定化方法 硅烷法是对金属表面进行活化的最常用的方法之一 而3 APTES则是最常用的硅烷化合物 一般过程为 先使表面氧化 然后与水等作用 形成富含 OH的活性表面 例如使用Pt Al电极就是因为这种电极的氧化层非常容易得到 然后用硅烷化试剂 常用3 氨丙基三乙氧基硅烷 3 APTES 的丙酮溶液 得到含氨基或羟基的活性表面 最后在直接进行生物敏感膜的固定或使用双功能试剂 如GA DSS等 固定 这种固定化方法适合表面为玻璃 活化硅胶 金 铝等 3 APTES分子式 OCH2CH3 3Si CH2 3NH2DSS 琥珀酸辛二酯 双功能试剂 24 B Arkles对硅烷偶联剂的作用过程提出了四步反应模型 即 1 与硅相连的3个Si X基水解成Si OH 25 2 Si OH之间脱水缩合成含Si OH的低聚硅氧烷 26 3 低聚物中的Si OH与基材表面上的OH形成氢键 27 4 加热固化过程中伴随脱水反应而与基材形成共价键连接 一般认为 在界面上硅烷偶联剂的硅与基材表面只有一个键合 剩下两个Si OH 或者与其他硅烷中的Si OH缩合 或者介质游离状态 28 例1 玻璃表面固定BSA 3 APTES分子式 OCH2CH3 3Si CH2 3NH2DSS 琥珀酸辛二酯 双功能试剂 29 例2 玻璃表面利用氨基硅烷固定葡萄糖氧化酶 30 例3 玻璃表面利用醛基硅烷固定葡萄糖氧化酶 31 例4 金表面利用氨基硅烷固定单链DNA1 表面预处理金表面在使用前要经过预处理 以除去表面的有机物质 先在1 2mol L的NaOH溶液中浸泡10min 用蒸馏水清洗后 再浸入1 2mol L的HCl溶液中浸泡10min 用蒸馏水清洗 接着用Piranha溶液浸泡30min 再依次用蒸馏水 丙酮 无水乙醇 纯净水清洗 最后用超声波清洗5min 2 金表面修饰 NH33 APTES是一种很好的表面活性剂 由于3 APTES上的硅原子一端可以与金等无机原子牢固结合 用3 APTES修饰镀金石英晶体片表面 形成Au O Si键 将3 APTES固定在金表面 这样金表面就形成为富含 NH2的表面 3 固定ssDNA加入ssDNA 金表面修饰的 NH2能与ssDNA的磷酸基团发生反应生成磷酰酯而固定ssDNA 从而将ssDNA牢固地结合在金电极上 32 硅或铝表面固定固定硅烷 33 4 2 2PEI固定法 PEI 聚乙烯亚胺 法属于聚合物膜法的一种 多用于比较研究 一般步骤为 先用2 4 的PEI甲醇溶液处理电极 得到PEI修饰层 再用戊二醛活化处理 然后与要固定的生物识别分子反应即可 这种方法的关键是控制PEI和戊二醛的浓度以及对未反应醛基的封闭 聚合物膜固定法中还可以采用其他聚合物如 羧甲基纤维素 聚丙烯酰胺 甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸乙酯共聚物 聚苯乙烯等 单体在电极表面现场生成聚合物膜的方法可以应用电聚合 等离子体聚合 甚至光聚合等技术来实现 这种聚合膜的特点是薄而均匀 比PEI法 APTE法的固定效果好 这种方法一般需要中间引物 一般为双功能物质 如戊二醛 所以封闭戊二醛未反应的醛基对于传感器的选择性和特异性至关重要 34 4 2 3SPA固定法 此法一般是利用一些如蛋白A 蛋白G和BSA等可以牢固地吸附在电极上 主要是金电极 而且本身又可以结合或标记上生物物质的特点来实现 这种方法具有生物毒性小的优点 对活体测定有一定的潜力 蛋白A固定法的一般步骤为 1 先在1 2mol L的NaOH溶液中浸泡10min 用蒸馏水清洗后 再浸入1 2mol L的HCl溶液中浸泡10min 用蒸馏水清洗 2 然后用PBS缓冲溶液 pH7 2 浸泡或涂覆金表面 就得到蛋白A修饰的传感器表面 这一表面可以用来直接固定抗体 由于蛋白A与免疫球蛋白IgG可以特异性结合 因此蛋白A修饰的传感器表面可以用来直接测定免疫球蛋白IgG 35 SPA法被公认为是一种非常有效的抗体固定方法 这是因为蛋白A具有与抗体的Fc段结合的特性 而抗原与抗体的结合位点在抗体的Fab段 故蛋白A与抗体结合后不影响抗体与抗原的结合 且蛋白A与金的亲和常数高达108mol L 修饰层稳定 操作简单 无须中间物 如交联剂 引入 因此有很好的重现性及稳定性 研究表明蛋白A在电极上成膜好坏与蛋白质浓度及成膜时间等因素有关 浸泡法优于涂覆法 前者自组装所形成的功能膜有序致密 且活性损失更小 而后者固定抗体增大了蛋白A非特异性吸附 重现性要差一些 不过需指出的是SPA法只能用来固定抗体 而不能固定抗原或其它生物物质 36 4 3LB膜技术 生物传感器的响应速度和响应活性是一对相互影响的因素 以酶传感器为例 一般情况下随固定的酶量增大 响应活性相应增高 但酶量大会使膜的厚度增加 造成响应速度减慢 近年来盛行研究用于活体测定的微型传感器 传感器的直径在微米级 生物膜的制作技术也必须与之相适应 于是有些学者将注意力转向Langmuir Blodgett LB 膜技术 37 LB膜基本原理是 许多生物分子 如脂质分子和一些蛋白质分子 在洁净的水表面展开后能形成水不溶性液态单分子膜 小心压缩表面积使液态膜逐渐过渡到成为一个分子厚度的拟固态膜 图3 5 这种膜以技术的发明者命名 称为LB膜 LB膜实验对液体的纯度 pH和温度有很高的要求 液相通常是纯水 操作压力通过压力传感器和计算机反馈系统调整 38 一旦制备好单分子膜 可以将膜转移到预备好的基片上去 转移过程通过马达微米螺旋系统进行操作 使基片在单分子膜与界面作起落运动 当基片第一次插入并抽出时就有一层单分子膜沉积在基片表面 若要沉积三层单分子膜 就需作第二次起落运动 图3 6 部分单分子膜被移出膜槽所引起的槽内压强变化由压力传感器和反馈装置进行自动压力补偿 39 利用LB膜技术制作酶膜主要有两个优点 一 酶膜可以制得很薄 数纳米 厚度和层数可以精确控制 二 可以获得高密度酶分子膜 由此可能协调响应速度和响应活性这对矛盾 需要解决的一个特殊问题是 酶分子多为水溶性 难以在水相中成膜 可能要设计更复杂的膜结构 如先将双功能试剂把酶分子轻度交联 使其能在水面悬浮展开 再施加压力形成单分子膜 或者借助脂质分子的双极性在脂质单分子层上嵌入酶蛋白分子膜来制备LB酶膜 40 基本步骤如下 使两性化合物在水相上形成单分子膜 用三甲基氯盐配制的10 的甲苯溶液处理SnO2电极 使其疏水化 在20mN m2的表面压力下用垂直提升法使单分子膜沉积在SnO2电极表面 2 5 戊二醛处理单分子膜1h 使外层引入甲酰基团 表面甲酰基团与GOD溶液反应1h 形成单分子GOD膜 采用LB技术首次制成GOD电极 41 4 4分子自组装 SAM 技术 随着生命科学 材料科学和纳米科学的发展 分子有序自组装化学 尤其是分子有序单层及多层组装膜越来越引起科技界广泛关注 通过对自组装分子的设计 可以达到人为控制表面组成 结构及其功能的目的 Langmuir blodgett LB 膜 自组单层膜或简称自组膜 self assembledmonolayer SAM 是目前研究广泛 对固体表面进行修饰最为有效的两种分子有序组装体系 分子自组装可以从分子水平上设计多种有序的结构 为器件的应用 如非线性光学器件 具有选择性化学响应的传感材料的合成 微电子器件及电分析化学和生物传感器等方面的发展开辟了广阔的前景 本节重点介绍自组装单分子膜的制备与表征 42 自组装单分子膜的主要体系 有机硅烷 SiO2 或Al2O3 玻璃 石英 硅 云母 GeO2 ZnSe 烷基硫醇 金 或银 铜 最常用 二羟基硫化物 RSR 或二羟基二硫化物 RS SR 金 醇 或胺 铂 羧酸 Al2O3 或GuO AgO 自组装分子 传感器表面 43 4 4 1单分子自组装膜概述 自组单层膜是分子自发地强化学吸附在固 液或气 固界面形成热力学稳定和能量最低的有序体系 特点 高度有序 定向密集 组织完好和稳定的分子单层 SAMs的组成结构和功能关系易于调控及表征 而且制备方法简易 是研究表面和界面现象的理想模型体系 44 SAMs的形成是三种作用力作用的结果 1 长链有机分子的头基与传感器基底之间强烈的化学键合作用 2 自组分子链之间的范德华相互作用 3 分子链内或末端特殊功能团之间的相互作用 由于这三种性质不同的相互作用 推动了自组装过程 也促进了自组装分子在传感器表面上成膜由无序到有序的重组 属于高度有序的复杂组装体系 传感器基底 头基 尾基 分子链 45 这种高度有序表现在有序具有多重性 化学吸附在基底表面上的头基在二维平面空间中具有准晶格结构 为第一重有序 长链结构的自组分子的轴方向有序排列 为第二重有序 镶嵌在烷基链内或其末端的特殊功能团也具有准晶格结构 为第三重有序 第二重有序 第一重有序 第三重有序 46 自组装现象的发现可以追溯到1946年Zisman以及后来Kuhn的工作 在过去20年中 自组膜的构造与表征无论在研究的深度还是广度方面均有了长足的进步 1983年 美国化学家Nuzzo和Allara的工作成为自组膜发展史上的里程碑 他们通过在双硫化合物的稀溶液中吸附的方法 在金表面制备了致密的硫醇自组膜 通过设计自组装分子使其具有不同的头基和尾基 可以在大的自由度上控制自组膜体系所涉及的作用力 自组分子与基底 自组分子之间 内含特殊官能团之间 自组分子与溶剂之间的相互作用等 47 研究这些相互作用可以加深我们对与其密切相关的结构 润湿 黏接 润滑以及特殊电化学 光化学等方面的了解 推动自组装技术在近代高科技的广泛应用 另一方面 SAMs所具有的明晰微结构 为电化学研究提供了一个重要的实验场所 藉此可以探测在电极表面上分子微结构和宏观电化学响应之间的关系 与用常规方法制备的化学修饰电极相比 SAMs是分子单层膜化学修饰电极发展的最高形式 它将在提高分析检测的灵敏度和选择性 在控制电活性中心与电极距离 研究长程电子转移等电分析化学的应用和理论方面发挥重要作用 48 SAM成膜与众所周知的LB成膜最本质的区别在于 前者属于化学吸附 后者属于物理吸附 生物分子识别元件在基片表面的化学吸附是一个放热过程 从热力学角度分析它有利于膜的形成 分子将尽可能多地与基片表面键合 尽可能达到最紧密排列 烷基链间的范德华力促使分子紧密排列 49 4 4 2分子自组装单层膜的类型和表征 1 自组膜的类型常见的SAMs的类型有 脂肪酸在金属氧化物表面强吸附形成自组膜 表面硅烷化形成有机硅烷自组膜 有机硫化物在金属表面和半导体表面形成自组膜等 50 1 脂肪酸在金属氧化物表面的自组膜长链的脂肪酸 CnH2n 1COOH 是典型的LB膜成膜分子 但是它也可以形成自组膜 如图 其动力来源于羧基阴离子与金属氧化物表面阳离子的成盐过程 Allara和Nuzzo研究了直链脂肪酸在氧化铝表面形成的自组膜 Pemberton等对上述化合物在氧化银表面上的组装结构做了考察 Tao等利用接触角等方法比较详细地考察了双炔酸化合物的自组膜 饱和脂肪酸在某些金属或其氧化物表面 酸 碱反应 形成表面盐 RCO2 M 51 2 有机硅烷在羟基化表面的自组膜有机硅烷衍生物在羟基化的表面形成自组装膜是基于有机硅烷与基底表面的羟基结合 如左图 同时伴随着横向的Si O Si形式的交联 从1980年Sagiv报道C18H37SiCl3 OTS 在玻璃片上形成自组膜以来 可供利用的基底包括二氧化硅 氧化铝 石英 云母 氧化锗和金等 另一种自组装法是饱和烷基链直接键合于半导体硅表面 如右图 饱和烷链直接键合于半导体硅表面 自由基反应 形成硅烷化台物 有机硅衍生物在羟基化表面上 聚合反应 形成聚硅氧烷结构 52 相对来说 构造硅烷衍生物自组装膜有一定难度 主要有三个方面的问题 一 溶液中水的含量 完全无水和含水过多均会引起自组膜的不完整性 二 自组装膜形成时的温度较难控制 三 基底的影响 从这个意义上来讲 无论从实验的重复性 还是膜的最终结构方面均不如羧酸自组装膜或硫醇自组装膜理想 53 3 有机硫化物在金属表面 半导体表面的自组装膜 下节详细介绍 硫化物在金属表面或半导体表面形成的自组装膜是目前研究得最广泛 最深入的一类 如图 除硫醇类外还有硫醚 双硫化合物 苯硫酚 巯基吡啶 原磺酸盐等可在金属表面形成自组膜 适合于含硫化合物形成自组膜的基底材料除单晶或多晶的金以外 还包括银 铜 铂 汞 铁以及胶体金微粒等 有机硫化物在金属或半导体表面上 以金为典型 软 硬酸碱反应 形成硫醇盐 RS M 54 一般认为硫醇分子在金表面的结合是S H键断裂并伴随着氢分子的生成 R S H Aun0R S Aun0 1 2H2在完全无氧的气相条件下同样形成分子自组装单层膜 是以上机理的证据之一 最近以来 人们用多种方法对RS 的生成机理进行了证明 对于Au S键的键合强度 一般推测为40kcal mol 用电化学方法求得上述过程的反应热为 5 5kcal mol 和理论预测值比较接近 5kcal mol 分别取RS H H2 RS Au的键能为87 104和40kcal mol 55 设计合成末端带有功能基团的硫醇分子 在表面研究中占有重要位置 烷基链末端导入的功能团有 CH3 CF3 CH CH2 C CH X CN OH OCH3 NH2 N CH3 2 SO3H S OCH3 3 COOH COOCH3 COONH2等 另一方面 将特殊活性基团引入自组装膜中进行考察 例如含电活性基团的自组装膜被广泛用于电子传递的动力学研究 56 4 其他类型的自组膜硅表面的烷烃分子自组单层膜是在硅表面通过C Si化学键合而形成的 Linford和chidsey利用RC O O O O CR与硅表面 H Si 111 或H Si 100 的多步自由基反应 获得较为致密的自组膜 Si R与Si O O CR的形成增加了成膜性 但是在热水中浸泡 表面分子浓度则有较大的下降 可能是Si O O CR被还原脱落所致 用烯烃和 RC O O 2的混合物进行反应也可以得到致密有序的分子单层膜 其覆盖度只有90 左右 表明仍然有较多的缺陷 同时椭圆偏振与红外的数据也证明 亚甲基链与垂直方向的夹角接近45 分子轴向的偏转角为53 可以认为是由于分子间距较大 0 665nm 而造成 57 5 分子自组单层膜表面的进一步功能化由于许多化合物可以和自组膜表面的尾基反应且不影响自组膜本身的结构 而尾基的反应主要受膜的空间效应及静电作用影响 因此自组膜上可以进一步连接更多样的功能分子从而有目的地裁剪表面的组成及特性 扩展了自组膜的研究和应用范围 自组膜表面上的酯基可以在亲核试剂作用下发生水解 转化为羧基或羟基 构成自组膜的分子间可以发生聚合反应 聚合后的自组装膜会增加膜的稳定性 减小受热脱附 并能抑制自组膜与溶液中硫醇的交换反应 自组装膜的聚合包括末端乙烯基团的交联 末端吡咯基团的电聚合等 58 通过配对键合反应也可以在自组装膜表面共价连接新功能化合物 最常用的共价转化反应是在配对试剂碳化二亚胺 EDC DCC等 作用下 形成酰胺和酯基 大多数蛋白质 酶 或其他生物分子都是通过其暴露的 NH2基或 COOH基与自组膜表面末端 COOH基或 NH2基发生配对反应而键合到电极表面或戊二醛作用下发生胺基缩合反应被固定 利用生物分子的特异性相互作用也可以较稳定地键合 如生物素 亲合素间的识别反应 NADH与其对应的酶分子间的重组 自组膜上的DNA单链与其互补链之间的杂交反应等 59 2 自组单层膜的表征SAMs所具有的有序 密集和稳定等特点 有利于用近代物理和化学技术进行表征 有关研究多集中在金表面 以硫醇类SAMs体系为代表 物理法包括接触角 椭圆偏振 X射线光电子能谱 XPS 石英晶体微天平 QCM 红外光谱 表面增强拉曼 SERS 扫描隧道显微镜 STM 原子力显微镜 AFM 荧光光谱 表面等离子体共振 SPR 等方法 化学法中主要是电化学的循环伏安 CV 法和交流阻抗 EIS 法 特别便于检测SAMs的品质 还能给出膜中缺陷的分布 膜的形成机理和过程动力学 基团的氧化还原行为 以及电子转移速率与距离关系等 60 4 4 3金表面的硫醇自组装单分子膜及生物分子固定 自组装 SAM 技术是一种应用较晚但发展非常迅速的技术 应用它可以在电极表面获得致密有序的单分子层 而且分子另一端可以带上不同的活性功能团 因而可适应不同的修饰电极的要求 硫醇分子在金表面的自组膜是最有代表性和研究最多的类型SAMs体系 61 4 4 3 1为什么传感器基底一般选择金 主要基于以下三个原因 1 金是一种相当惰性的金属 不易被氧化 并且具有抗大气污染的优点 2 在存在有其他许多功能团的情况下 金与硫之间具有强烈的作用 键能184kJ mol 很少有其他基团与之竞争 保证了这种吸附的选择性 而形成单分子膜的能力 从而提高了自组装的选择性 减少了膜的杂质 3 巯基分子在金表面能够形成非常紧密排列的晶态或液晶态单分子膜 由于巯基与金的结合非常牢固 所以在生物传感器的研究中 金电极表面上硫醇分子的SAM应用最多 62 在金电极上 硫醇分子与Au 表面形成六方晶格 相邻硫原子间距为0 497nm 烷基链间的平均距离为5 0埃 单个硫醇分子所占面积为0 214nm2 通过电子衍射 原子力显微镜表征进一步证实该高度有序排列结构 烷基链并不完全垂直于金表面 而有一定的倾斜角 30 即烷基链与金表面法线的夹角 在高度有序的自组膜中 硫醇的头基影响自组膜的倾斜角 末端基团的取向还与硫醇头尾基之间亚甲基数有关 奇偶 效应 当自组膜修饰电极放置于溶液中 膜的外部有序性会稍稍降低 其降低程度跟膜的末端基团与溶液的作用情况有关 63 4 4 3 2为什么自组装分子常选择硫醇 常用的SAM成膜物质主要有 二硫化合物 R SS R 硫化物 R S R 以及巯基化合物 R SH 其中巯基化合物应用最为广泛 其在金电极上自组装的经典反应为 烷基硫醇在金表面的自组装具有如下特性 1 成膜速率越低 膜的有序性越好 2 在溶液中 烷基硫醇不易聚合 成膜的条件容易控制 3 选择性愈高 吸附的杂质愈少 4 在超高真空条件下 采用蒸发镀膜的方法可以制备具有原子级平整度的基片 64 烷基硫醇在自组装单分子膜的研究中扮演了重要角色 在大多数情况下起着不可替代的作用 正是烷基硫醇使得自组装单分子膜的研究内容丰富多彩 烷基硫醇和烷基二硫醇具有显著的特征 例如HS CH2 nX X SH OH COOH NH2等 分子含有两个活性基团 此外分子链可以含有烯双键 CH CH 炔三键 C C 偶氮 N N 基 共轭烯键 CH CH CH CH 共轭炔键 C C C C 和其他特殊功能团 在分子自组装时 单分子膜形成后分子链的活性尾基X可以继续与其他物质反应 所以烷基硫醇起到的作用相当于 多功能桥 MFB 如果分子链含有不饱和功能团如 C C CH CH C C C C CH CH CH CH 单分子膜还可以聚合成网状聚合物 65 4 4 3 3金表面自组装硫醇分子的步骤及影响因素 金表面的自组装单分子膜的制备方法一般是 1 在进行自组装前必须进行预处理以除去金表面的有机物和杂质 其预处理方法为 先用1 2M的NaOH溶液浸泡10分钟 再用1 2M的HCl溶液浸泡10分钟 然后用三蒸水清洗几次并晾干 2 迅速置于一定浓度的硫醇乙醇溶液中浸泡一段时间 3 取出电极并用三蒸水冲洗干净 这样 金电极表面即可修饰上一层表面带特定功能基团的单分子层固相膜 其中浸泡时间长短的选择对自组装膜的好坏 是否均匀 致密 非常关键 这主要与硫醇的性质以及浓度有关 为了得到致密的分子单层膜 可采取适当的 退火 处理 如将自组膜电极插入热的修饰液中 或经循环伏安扫描 或在修饰液中反复浸泡等以获得致密稳定的分子单层膜 66 其他金属电极上自组膜的沉积也可以在一定的电位控制下进行 以确保金属处于还原态 但在碱性溶液中过负的电位下 自组膜会脱附 利用此特性可以在硫醇的碱性溶液中从脱附电位处正向慢慢扫描而形成自组膜 如果硫醇容易挥发 也可以在蒸气相中进行自组装 这样得到的自组膜与溶液中吸附所得的自组膜没有大的差别 67 自组装单层膜法虽然在检测的灵敏性和可重复性方面有很大提高 稀溶液中硫醇可以在1h内组装形成单层自组膜 组装时间与硫醇的烷基链链长有关 一般浓度高则所需的时间短 通常自组装膜可以覆盖整个金表面 但针孔或缺陷会导致硫醇残基的氧化使金 硫键氧化断裂 成膜分子倒伏或脱落 影响生物分子固定的效果 并且针孔对于电导 电容等电化学检测所造成的误差是十分可观的 取代的烷基硫醇形成的自组膜有较高的有序性和取向度 对于尾基相对较小的基团如 NH2 OH 则自组膜的取向度不会受到影响 但对于较大的尾基如 COOH 则会降低自组膜堆积的密度 降低尾基的有序性 此时可以与短链硫醇以一定摩尔比混合自组装 形成混合自组膜 68 影响分子自组装和单分子膜的品质的因素较多 主要因素包括基片表面物质和表面的粗糙度 活性分子反应基团的活性和空间位阻 分子链的大小和极性 溶质的极性和溶液的浓度等 自组装的速率受到多种因素的影响 有温度 溶剂 溶液浓度 吸附分子的链长和基片物质的清洁程度等 这些因素是相对容易控制的 有的因素如界面反应的速率和单分子层吸附的可逆性是由系统本身决定的 69 4 4 3 4生物识别分子的固定 生物识别分子主要通过两种途径在自组装膜上进行固定 1 选择带合适功能团 如 NH2 COOH OH等 的硫醇先进行自组装 然后再通过活性功能基团来固定生物识别分子 2 先将生物识别分子标记上巯基 SH 基团 然后直接通过自组装来达到固定生物识别分子的目的 现一般采用前一种方法 因为这种方法在传感器的制作上比较简单 而后一种方法需要许多化学合成方面的知识 而且可能对生物识别分子的活性有影响 所以我们主要介绍第一种方法 70 自组膜的活泼性尾基 功能基团 如 COOH NH2 OH等在与生物识别分子固定 偶联 前一般需要先进行活化活化有两个目的 加速和提高自组装膜上的尾基与生物识别分子的固定速度和固定量 由于目前用于生物分子固定的多为一些小分子硫醇 而这些自组装膜具有较强的刚性 生物相容性较差 不利于生物传感器灵敏度的提高 71 尾基 COOH通常用碳二亚胺 EDC CMC N N 羰基二咪唑 CDI 对硝基酚 磺酰氯等活化 EDC与NHS N 羟基琥珀酰亚胺 联合使用能提高生物识别分子的固定效率 使氨基和羧基之间的缩合反应变得更容易 因为它把羧基转化为一种更具有反应活性的中间体 尾基 NH2可以用戊二醛 TST 三氯 S 三嗪 等活化 形成的活泼酯或酰氯等活泼化合物与生物分子中的氨基反应生成酰