Transwell试验方法.doc

Transwell细胞侵袭实验与移动实验一、试剂和耗材1) 细胞及细胞培养基：KYSE150细胞、含10%FBS的RPMI1640培养基及无血清RPMI1640培养基。2) 10PBS (pH7.0)：Na2HPO412H2O （MW 358.4） 2.87gKH2PO4（MW 136.09） 0.2gNaCl（MW 58.44） 8.0gKCl（MW 74.55） 0.2g去离子水至 100 ml高压灭菌后，室温保存。使用液为1PBS(用无菌水进行1：9 稀释)。3) 冰乙酸:甲醛（1:3）4) Transwell小室 (BD, Bioscience)5) Matrigel基质胶（BD, Bioscience，50ug/ml）：商品化，保存-20。6) 各种规格的枪头、1.5ml离心管及10ml玻璃离心管：高温灭菌后备用，其中准备一些枪头与1.5ml的离心管于-20C预冷，备用。7) 5810R台式高速冷冻离心机（Eppendorf），TC10全自动细胞计数仪（Bio-Rad）8) 细胞计数板、6孔板二、实验步骤（一）侵袭实验1. 润化：在无菌台上取出Transwell小室，置于24孔培养板内，小室内和放小室的孔内均用加少量无血清培养基，润化5-15min。2. 细胞准备：在做实验前12h，弃去培养基，用PBS洗三次，每瓶细胞加入5ml无血清培养基，常规培养24h。3. 细胞的接种：1) 弃去无血清培养基，常规胰酶消化细胞，若室温过低可置于37培养箱中消化，消化时间不宜过长，控制在1min以内。2) 加入4预冷的无血清培养基（建议6孔板2ml，培养瓶5ml），轻轻吹打均匀后，收集至10ml玻璃离心管中（带螺口盖子），水平转子4、700rpm/min，离心5min；3) 弃除上清，适量无血清洗涤细胞并离心；4) 弃除上清，加入适量无血清培养基重悬细胞（根据细胞消化前满度进行初步稀释，建议初步稀释至细胞密度大于1.5105/ml），轻轻吹打均匀后，取10ul细胞悬液用于Bio-Rad TC10细胞计数；亦可取15ul细胞悬液与等体积台盼蓝染液混合后取10ul用于Bio-Rad TC10活细胞计数；5) 计数后，取无血清培养基重悬一定体积的细胞悬液，将细胞密度调整至1.25105/ml；6) 将一定数量Transwell小室放入BD公司24孔板，取上述细胞悬液400l（含5104细胞）逐滴加入小室；取500l含10%血清的培养基沿小室侧壁与孔壁的空隙处加入到孔中，并保证小室膜与培养液之间无气泡。7) 将接种好的细胞放入培养箱，37、5%CO2条件下常规培养24h，此过程不宜晃动细胞板。4. 细胞染色及拍照：1) 弃孔内培养基，将小室取出，弃去孔中培养基，PBS漂洗3次，将小室内PBS吸干净，此过程要求快速完成，避免让小室的膜过于干燥，将小室置于已加入500ul固定液的培养孔中，在上室中加入200ul固定液，固定5-10分钟左右。此过程要将保证培养板盖有盖子，以防挥发。2) 弃去孔中固定液，PBS漂洗3次，将小室内PBS吸干净，将小室置于已加入500ul苏木素染液的培养孔中，上室中加入200ul固定液，染色10-15min。3) 将小室转移至新的培养孔中，水洗至适当颜色，用棉签擦拭去小室内部未穿过上室膜面的细胞。4) 往小室内加入100ul PBS，倒置显微镜观察穿过去的细胞，200 光镜下计数10个视野的侵袭细胞数,取其平均值,以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞的侵袭能力。5) 若颜色偏浅，可以置于染色液中重复染色，水洗至适当颜色后即可。（二）移动实验1. 小室润化：在无菌台上取出Transwell小室，置于24孔培养板内，小室内和放小室的孔内均用加少量无血清培养基，润化5-15min，备用。2. 细胞准备：常规培养细胞，用PBS（已灭菌）或无血清培养基洗涤3次后，加入常规量无血清培养基饥饿12h。3. 接种Transwell小室1) 弃去无血清培养基，常规胰酶消化细胞，若室温过低可置于37培养箱中消化，消化时间不宜过长，控制在1分钟以内。2) 加入4预冷的无血清培养基（建议6孔板2ml，培养瓶5ml），轻轻吹打均匀后，收集至10ml玻璃离心管中（带螺口盖子），水平转子4、700rpm/min，离心五min；3) 弃除上清，加入适量无血清培养基重悬细胞（根据细胞消化前满度进行初步稀释，建议初步稀释细胞密度大于1.5105/ml），轻轻吹打均匀后，取10ul细胞悬液用于Bio-Rad TC10细胞计数；亦可取15ul细胞悬液与等体积台盼蓝染液混合后取10ul用于Bio-Rad TC10活细胞计数；4) 计数后，取无血清培养基重悬一定体积的细胞悬液，将细胞密度调整至1.25105/ml；5) 将一定数量Transwell小室放入BD公司24孔板，取上述细胞悬液400l逐滴加入小室；取500l含10%血清的培养基沿小室侧壁与孔壁的空隙处加入到孔中，并保证小室膜与培养液之间无气泡。6) 将接种好的细胞放入培养箱，37、5%CO2条件下常规培养24h，此过程不宜晃动细胞板。4. 细胞染色（Giemsa试剂盒）及拍照：（三）Transwell小室重复利用处理方法1 拍照结束后，将小室直接放入6孔板/24孔板中，小室上下均加入适量胰酶，使膜浸泡在胰酶中，室温放置过夜（约6h以上）；2 将小室取出，用75%乙醇浸泡5min（可将小室全部没入乙醇中），重复三次，以除去苏木素染色；3 无菌水漂洗几次以除去残留物质，甩干水后，置于室温