第二章 生物酶解技术.ppt

第二章生物酶解技术 细胞壁的层次 胞间层 中层 middlelamella 果胶类物质组成 具强的亲水性和可塑性 初生壁 primarywall 细胞生长过程中 原生质分泌 有纤维素 半纤维素和果胶 还含有酶和糖蛋白 次生壁 secondarywall 细胞停止生长 原生质产生的壁物质沉积在初生壁内侧 由纤维素 半纤维素和木质素构成 分内层 S3 中层 S2 和外层S1 生物酶解技术在中药提取中的应用 细胞壁的化学组成 纤维素 cellulose 由葡萄糖分子串联而成 结构单位 微团 micelle 微纤丝 microfibre 大纤丝 macrofibre 纤维素的网络结构中交联半纤维素和果胶类物质 目前 生物酶技术在现代中药提取中正展示着其独特的优势 引起了许多企业和科研单位的关注 并已经开始了在这一领域的探索和应用 世界上广泛开展了有关酶的性质的研究 至今已从动物 植物中发现了两千多种酶 并有两百多种酶已得到结晶 第一节概述 一 酶的概念 酶的概念 酶是由生物细胞产生的以蛋白质为主要成分的生物催化剂 生物体内的反应是在很温和的条件 如温和的温度 接近中性的pH 下进行的 而同样的反应若在非生物条件下进行 则需要高温 高压 强酸 强碱等剧烈的条件 酶的专一性 每一种酶只能催化一种或一类的化学反应 酶的催化效率是无机催化剂的107 1013倍 酶的高效性 酶的作用条件较温和 酶所催化的反应一般是在比较温和的条件下进行的 第二节酶反应的特点与影响酶活性的因素一 酶反应的特点 酶活力 是酶促反应的能力 酶活力大小就是指在一定条件所催化的某一化学反应速度的快慢 即酶催化的反应速度越快 酶活力越高 反之则表示该酶活力低 二 酶活力与酶单位 酶的定量并非对其蛋白质进行定量 而是对它的催化能力进行定量 所以 酶的定量就是测定酶的活力 也即测定酶促反应的速度 1 酶活力概念 A 国际单位 U 这种单位是由国际酶学委员会规定的 在标准条件 25 最适pH 最适底物浓度 下 酶每分钟催化1mmol底物转化 这样的速度所代表的酶的活力即酶的量定义为1个国际单位 IU 2 酶活力与单位 指每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数 比活力是酶制剂纯度的常用指标 比活力越大 表示酶越纯 比活力 酶活力单位数 U 酶蛋白质量 mg 3 酶的比活力 三 影响酶活性的因素 酶解提取中药有效成分 均有较高收率 具有较大应用潜力 但该技术也存在着局限性 酶法提取对生产条件要求较高 为使酶发挥最大作用 并将其用于工业化时 必须综合考虑酶的浓度和底物浓度 温度 pH 作用时间等对提取物的影响 温度对酶反应速度的影响具有双重性 1 温度对酶反应速度的影响 因此 在这双重因素的综合作用下 酶促反应具有一最适温度 四 温度对酶反应速度的影响 不同酶的最适温度也不一样 动物酶的最适温度一般在35 40 植物酶为40 50 酶的最适温度并非酶的特征性常数 它与底物 作用时间等因素有关 2 pH对酶反应速度的影响 pH对酶反应速度的影响较大 其原因有 每种酶只能在一定的pH范围内表现出它的活性 且在某一pH值范围内活性最高 其两侧活性都下降 酶促反应具有一最适pH 反应速度和pH的关系见下图 酶的最适pH一般在7左右 也有很多例外 如胃蛋白酶的最适pH只有1 5 木瓜蛋白酶 5 6 胰蛋白酶 7 8 酶的最适pH并非酶的特征性常数 它与底物的种类 浓度等因素有关 2 pH对酶反应速度的影响 对于简单的酶反应 当酶浓度和其他条件恒定时 Vmax 零级反应 一级反应 混合级反应 该曲线可以用米氏方程来描述 3 底物浓度的影响 4 酶浓度对酶反应速度的影响 在一般的酶促反应中 常常 S E 酶反应速度达到最大反应速度 当 S E 由于Vmax k E 0 反应速度与酶浓度成正比 酶浓度曲线 某些物质能使酶的活性增强 成为酶的激活剂 某些物质能使酶的活性降低 成为酶的抑制剂 再如一些金属螯合剂如EDTA 乙二胺四乙酸 等能除去重金属离子对酶的抑制作用 也可视为酶的激活剂 5 激活剂对酶反应速度的影响 激活剂 能提高酶活性的物质 无机离子 主要是金属离子 它们有的本身就是酶的辅助因子 有的是酶的辅助因子的必要成分 如 激酶需要Mg2 激活唾液淀粉酶需要Cl 激活 主要的激活剂有 5 激活剂对酶反应速度的影响 有机小分子 一些还原剂 如抗坏血酸 半胱氨酸 使含 SH的酶处于还原态金属螯合剂 如EDTA 乙二胺四乙酸 可络合一些重金属杂质 解除它们对酶的抑制 从而使酶活升高 抑制作用 有些物质与酶结合后 引起酶的活性中心或必需基团的化学性质发生改变 从而使酶活力降低或丧失 6 抑制剂对酶反应速度的影响 第三节生物酶辅助提取中药成分的机制 酶解破壁 有效成分的提取 纤维素酶解提取 原理 内切葡聚糖酶纤维素酶纤维素二糖水解酶 葡萄糖苷酶 甘露聚糖酶半纤维素酶 木聚糖酶 葡萄糖苷酶 甘露糖苷酶 木聚糖苷酶果胶酶聚 1 4半乳糖醛酸的聚糖水解酶果胶质酰基水解酶 酶解优点 第四节生物酶解辅助提取条件优选 一 酶辅助提取条件的优选植物根茎类药材 纤维素酶种子药材 纤维素酶 半纤维素酶花类 果类 选用果胶酶动物药材 蛋白酶 一 酶的种类 1 酶对有效成分的影响催化水解酶 纤维素酶 对苷类药材的影响P48 2 复合酶的作用 由于植物组织细胞壁的多样性 有时采用复合酶 但由于复合酶的作用广泛应考虑对有效成分的多重影响 有效成分含量明显超过单一酶复合酶综合作用有效成分含量低于单一酶 复合酶解法提取三七皂苷结果比较 提取方法皂苷含量 平均纤维素酶解法9 468 789 469 23果胶酶酶解法8 908 649 168 90复合酶解法11 2611 3810 9711 17 二 酶解温度 温度升高加速化学反应但酶的本质是 所以温度超过一定范围 所以对同一种酶在一定温度范围内活性随 升高而 对于对不同药材酶的最适合的温度可以通过实验考查来确定 方法 固定酶的用量 作用时间 酶解液的PH值等相同的条件 将酶解液分成若干份 分别控制不同的温度进行酶解反应 测定代表性的有效成分为考查指标 根据含量多少确定最合适的酶解温度 实例1 苦荞茎叶粉中总黄酮酶法提取工艺研究 总黄酮的UV法测定法 标准曲线的制备 将芦丁于120 烘箱中烘于干燥器中冷 却后称至恒重 称取50mg用70 乙醇溶解 定容至250mL 得0 200mg mL芦丁对照品溶液 准确吸取芦丁对照品溶液0 3 0 6 0 9 0 12 0 15 0mL于50mL量瓶中 加入5 NaNO2溶液15mL 摇匀 放置6min后加入10 Al NO3 3溶液15mL 摇匀 放置6min后加入4 NaOH溶液20mL 再用70 乙醇定容 摇匀 以70 乙醇为空白参比 10min后用1cm比色皿于510nm测定吸光度 得芦丁的回归方程 Y 0 0749A 0 0022 R2 0 9961 苦荞茎总黄酮的测定 准确称取2 50g苦荞茎叶粉 于250mL三角瓶中 加入50mL水 按试验设置的处理条件 在不同的加酶量 酶解温度和pH值条件下 酶解不同的时间 然后升温至90 提取 离心去沉淀 用70 乙醇定容至200mL 作为待测液 取3mL待测液于50mL量瓶中 按照标准曲线的制备项下方法测定吸光度 计算总黄酮的质量 并计算总黄酮得率 总黄酮得率 提取液中总黄酮质量 苦荞茎叶粉质量 100 单因素考查法 一 温度 二 酶用量 酶解温度55 pH6 5酶解2小时纤维素酶 三 酸碱度 固定纤维素酶的量 酶解温度 时间2h 考查pH影响 四 酶解时间 固定 纤维素酶量 酶解温度55pH6 5考查不同时间 二 酶解技术的工艺设计 实例1 苦荞茎叶粉中总黄酮酶法提取工艺研究1 酶解液黄酮成分测定2 正交实验设计 由表中可知 各因素对提取效果的影响顺序依次为A B C即酶解温度酶解时间达到极显著水平 P0 05 最佳工艺组合为A2B2C3 直接水提和酶法水提效果比较 在酶解辅助提取过程中 酶的种类 酶解温度 酶解时间及酸碱度各因素的影响不是孤立的 而是相互影响的 所以要在单因素考查的基础上 通过正交试验综合考虑 以获得更好酶解提取效果 第五节酶解技术在中药提取中的应用 一 酶解技术在中药成分提取中的应用 一 多糖实例2 甘草多糖的酶辅助提取运用正交设计法设计酶法提取工艺 采用分光光度法测定多糖含量 结果 酶法提取甘草多糖的最佳工艺是温度40 pH值5 0 加酶量5g kg 1 提取时间5h 提取率3 29 酶法提取甘草多糖速度快 提取率高 多糖的酶及超声联合提取 采用正交试验 优化玉米须多糖的酶及超声提取方案 并研究这两种方案的结合效果 结果三种提取工艺中联合提取多糖得率最高 酶辅助提取次之 超声提取最低 结论联合提取是一条高效的提取路线 方法超声酶法酶法 超声时间 min 20170190多糖含量 2 8785 6977 720 二 生物碱 生物碱一般采取方法 酶法辅助提取率比传统方法显著增加 生物碱结构无 键 不存在被酶水解问题 实例3 贝母生物碱酶辅助提取工艺研究 1 酶解条件单因素考查 2 酶解条件正交试验 pH 温度 由极差分析得到各因素对提取效果的影响度 A D B C 由此可见 酶解温度为主要因素 酶解时间为次要因素 其次是pH值 而酶用量的影响最小 因此得到最佳提取条件 提取温度为60 pH值为45 酶用量为2 5g L 提取时3 5h 验证试验 按原醇提取工艺进行3次试验 同时根据正交试验优选结果对酶解工艺进行3次重复试验 结果见表3 可见 两工艺重现性良好 但是加酶工艺比不加酶收率提高了3 92 二 酶解技术在中药成分转化中的应用研究证明 白藜芦醇具有抗菌 抗癌 抗炎 抗过敏 降血脂和抗氧化等多方面的药理活性 是目前研究较热门而有希望的抗癌药剂之一 白藜芦醇在虎杖中主要以苷的形式存在 因此 作者考虑将白藜芦醇苷转化成白藜芦醇苷元 这将大大提高白藜芦醇的得率 虎杖提取用乙醇 同样酶解技术可以用于提取黄酮类 皂苷类 苯丙素类 有机酸类 蛋白质类 挥发油 1 采用纤维素酶解法新工艺提取虎杖中白藜芦醇 即在乙醇提取前 先用纤维素酶处理虎杖粗粉 通过实验确定最佳的提取工艺条件为 提取温度50 酶解pH值5 0 酶解时间90min 纤维素酶与虎杖粗粉配比为1 500 与传统醇提工艺相比 提取率提高了近5倍 2 人参的有效成分为皂苷类 其中在红参与野山参中仅为十万分之几的人参皂苷Rh2等稀有成分 对肿瘤细胞具有凋亡等作用 对人体无毒且具有较高的保健功能 但人参皂苷Rh2结构复杂 以化学方法制备的难度高 污染大 收率低 金凤燮采用皂苷酶处理人参中常见组分Rb Rc Rd等二醇类皂苷生产Rh2等稀有皂苷 酶处理生产Rh2等的转化率在60 以上 比从红参中直接提取提高了500 700倍 三 酶解技术在中药提取液精制与纯化的应用 中药水提液含有多种类型的杂质 如淀粉 蛋白质 鞣质 果胶等 采用常规提取法时 煎煮过程中药材里的蛋白质遇热凝固 淀粉糊化 影响有效成分煎出 分离困难 针对中药水提液中所含的杂质类型 采用相应酶将其降解为小分子物质或分解除去 可解决上述问题 并改善中药口服液 药酒等液体制剂的澄清度 提高成品质量 例 采用木瓜蛋白酶对中药材 茯苓 牡丹皮 煮出液中的蛋白质进行降解 结果表明 在pH5 5 45 的最佳酶解条件下 茯苓和牡丹皮的浊度分别降低了14 和25 展望 通过酶工程技术可在温和条件下对药效成分进行高选择性转化 不仅能克服工业常用提取方法中提取率低 工序复杂等问题 还能提高提取体系的澄清度 改变药材质地 同时可以在提取中改变原有天然成分结构 增加提取物的生理活性 且耗能低 降低生产成本 减少环境污染 因此 酶工程技术对中药有效成分的提取具有潜在的工业应用价值 今后研究的主要方向应集中在 一 酶在中药提取过程中 对中药提取效率及生成产物的控制 二 一些重要中药化学成分的酶转化及合成 三 建立酶提取中药产物药理活性的快速筛选 四 酶反应产物结构的快速测定 五 特殊活性酶的筛选 总之 酶技术应用为开展中药生产和研究提供了新的机会和方法 应该加强酶技术在中药基础和应用上的研究 存在问题 酶法提取对实验条件要求较高 为使其发挥最大作用 需先经实验确定最适反应条件 如温度 pH及作用时间等 还需综合考虑酶及底物浓度 抑制剂和激动剂等对提取物的影响 酶反应个别目标成分的变化 酶与非目标产物的残留酶制剂的标准 国际酶学委员会 根据各种酶所催化反应的类型 把酶分为6大类 即氧化还原酶类 转移酶类 水解酶类 聚合酶类 异构酶类和连接酶类 此外 DNA合成技术的迅速发展为酶的遗传设计开创了令人鼓舞的美好前景 只要有遗传设计蓝图 就能人工合成酶基因 从而合成某一类酶 酶遗传设计的主要目的是创造优质酶 用于生产昂贵特殊的药品以满足人们的特殊需要 酶的分类 一 pH值对酶活性的影响酶的活性受环境pH的影响极为显著 通常各种酶只有在一定的pH范围内才能表现出它的活性 一种酶表现其最高活性时的pH值称为该酶的最适pH 高于或低于最适pH值时 酶的活性降低 酶的最适pH值受酶的纯度 底物的种类和浓度 缓冲液的种类和浓度以及环境温度等条件影响 二 温度对酶活性的影响每种酶都有其最适温度 高于或低于此温度酶的活性都降低 一般而言 若酶处于过高的温度环境中 会使酶活性永久地丧失 而若处于极低温度的环境中只会使酶活性受到抑制 一旦温度适宜 酶又会全部或部分地恢复其活性 三 酶浓度对酶促反应速度的影响在其它条件不变的情况下 若反应物浓度大大高于酶浓度时 则反应速度随酶浓度增加而增加 两者间成正比关系 即 V k E 但若反应底物浓度较低 而且酶的浓度足够高时 增加酶浓度 反应速度基本不变 四 离子对酶活性的影响就唾液淀粉酶而言 低浓度Cl一可以增加酶活性 高浓度的Cl一或者低浓度的Cu2 则会抑制酶的活性 而低浓度的Na SO42 等对酶活性没有影响 不同的酶对不同的离子具有不同的效应 酶的定义酶是由生物细胞产生的 受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂 与一般催化剂相比有其共同性 但又有显著的特点 酶的催化效率高 具有高度的专一性 酶的活性受多种因素调节控制 酶作用条件温和 但不够稳定 酶的分类国际酶学委员会 根据各种酶所催化反应的类型 把酶分为6大类 即氧化还原酶类 转移酶类 水解酶类 聚合酶类 异构酶类和连接酶类 此外 DNA合成技术的迅速发展为酶的遗传设计开创了令人鼓舞的美好前景 只要有遗传设计蓝图 就能人工合成酶基因 从而合成某一类酶 酶遗传设计的主要目的是创造优质酶 用于生产昂贵特殊的药品以满足人们的特殊需要 酶的最佳温度及最佳pH值往往在一个很小的范围内 为使酶的活性提高到最大值 必须严格控制酶反应时的温度及pH值 反应条件的微小波动 都可能是酶的活性大大降低 因此对实验设备有较高的要求 酶法提取过程中 有可能改变中药中某些成分 产生新的化学物质 从而影响产物的纯度及得率 许多