第五章+酶分子修饰.ppt

Chapter5DirectedEvolutionandModificationofEnzymeMolecule 酶的分子修饰和定向进化 Contentsofchapter5 1 酶的结构 2 酶分子修饰及其基本要求和条件 3 酶分子的修饰方法 4 酶修饰后的性质变化 Go Go Go Go 5 酶的定向进化 Go 酶分子修饰 酶作为生物催化剂 其高效性和专一性是其他催化剂所无法比拟的 因此 日益增多的酶制剂已用于食品发酵 疾病诊治和预防 环境保护和监测 化工产品的生产等领域 为什么要对酶进行修饰 酶在实际应用中有局限性 1 作为异体蛋白在体内难于吸收 易引起免疫反应和被识别降解 2 酶蛋白经不起温度 酸碱 有机溶剂及时间的考验 半衰期短 易变性失活 3 酶的活性 作用专一性和最适条件不一定能适应生产工艺要求 限制了酶制剂的应用范围 酶的结构 酶的结构 酶活性中心 activitysite 酶分子中直接与底物结合 并催化底物发生化学反应的部位 称为酶的活性中心 它是由三级结构中空间位置相邻的几个氨基酸共同构成的 酶的结构 酶活性中心 activitysite 酶的活性中心包括两个功能部位 一个是结合部位 是酶与底物结合的基团 决定酶的专一性 另一个是催化部位 催化底物敏感键发生化学变化的基团 决定酶的催化能力 但这两个部位并不是各自独立存在的 相互联系 酶的结构 酶的结构 活性中心的重要化学基团7种氨基酸出现的频率最高LysAspGluCysHisTyrSer某些功能基团 如 氨基 羧基 巯基 羟基和咪唑基 是酶的必需基团 维持活性中心应有空间构象所必需的基团 影响底物中某些化学键的稳定 催化底物发生化学反应并将其转化成产物 与底物相结合 使底物与酶的一定构象形成复合物 酶的结构 活性中心的共性 1 活性部位只占酶分子很小的一部分 1 2 活性中心 酶的结构 活性中心的共性 2 活性部位是一个三维实体 3 活性中心位于酶分子表面的疏水性裂缝中 酶的结构 活性中心的共性 4 活性中心构象不是固定不变的 诱导契合 酶的结构 活性中心的共性 5 酶与底物通过盐键 氢键 范德华力和疏水作用等次级键结合 酶的结构 Problem 既然活性中心如此重要 我们应该如何检测它呢 酶的结构 研究酶活性中心的方法1 物理学方法 用X射线衍射法直接检测底物或其类似物与酶形成的中间复合物 包括酶和底物 的相对位置 酶的结构 研究酶活性中心的方法1 物理学方法 X射线衍射原理 X射线是一种波长很短的电磁波 能穿透一定厚度的物质 当一束X射线通过晶体时将发生衍射 衍射波叠加的结果使射线的强度在某些方向上加强 在其他方向上减弱 分析在照相底片上得到的衍射花样 便可确定晶体结构 酶的结构 酶的结构 研究酶活性中心的方法2 化学修饰法1 非专一性化学修饰用非专一性的修饰试剂与氨基酸侧链基团相互作用 Problem 怎样判断化学试剂是同活性中心内的必需基团结合 Howtodetermine 酶的结构 研究酶活性中心的方法2 化学修饰法1 非专一性化学修饰某基团被修饰后 无非出现以下两种情况 酶活性不变 该基团可能不是酶的必需基团 酶活性降低或丧失 该基团可能是酶的必需基团 酶的结构 研究酶活性中心的方法2 化学修饰法1 非专一性化学修饰活性中心基团的鉴定标准 失活程度与修饰剂浓度成一定比例关系 S或可逆抑制剂有保护作用 活性中心 先加S加共价修饰剂透析除去S活性不丧失 酶的结构 研究酶活性中心的方法2 化学修饰法2 专一性化学修饰 1 基团专一性修饰用专一性化学修饰剂修饰酶活性中心的某一氨基酸残基的侧链基团 酶的结构 研究酶活性中心的方法2 化学修饰法2 专一性化学修饰 2 位点专一性修饰 亲和标记 采用的修饰试剂是根据底物的化学结构设计合成的含有活泼反应基团的底物类似物 作用机制 利用酶对底物的特殊亲和力将酶加以修饰标记 酶的结构 研究酶活性中心的方法2 化学修饰法2 专一性化学修饰 2 位点专一性修饰 亲和标记 含有活泼反应基团的底物类似物 与S结构相似 与活性中心的氨基酸残基亲和力大 而与活性中心以外的氨基酸残基亲和力小 具有活泼的化学基团 如卤素 可与活性中心的基团形成稳定的共价键 酶的结构 3 蛋白质工程 将酶相应的DNA定点突变 突变的DNA只表达一个或几个氨基酸被置换的酶蛋白 测定其活性可知被置换的氨基酸是否为活力所必需 改变酶特性有两种主要的方法 1 通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的活性 2 通过基因工程方法改变编码酶分子的基因而达到改造酶的目的 1什么是酶分子修饰 通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变 从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰 即 在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团 物质 特别是具有生物相容性的物质 进行共价连接 从而改变酶的结构和性质 酶分子修饰的原理 1 修饰剂分子存在多个反应基团 可与酶形成多点交联 使酶的天然构象产生 刚性 结构 从而增强酶天然构象的稳定性与耐热性 酶分子修饰的原理 2 大分子修饰剂与酶结合后 产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂 遮盖 了酶的活性部位 从而保护酶活性部位并起到低抗抑制剂和抗蛋白水解酶的作用 酶分子修饰的原理 3 酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后 减少了受蛋白水解酶破坏的可能性 4 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇 与修饰剂形成了共价键 破坏了抗原决定簇 抗原性降低乃至消除 遮盖 了抗原决定簇 阻碍抗原 抗体结合 消除酶的抗原性 使酶稳定 酶分子修饰的原理 5 大分子修饰剂本身是多聚电荷体 能在酶分子表面形成 缓冲外壳 抵御外界环境的极性变化 维持酶活性部位微环境相对稳定 修饰剂的选择原则 1 修饰剂的分子量及链的长度 要求有较大的分子量 2 修饰剂上反应基团的数目及位置 要求有较多的反应活性基团 3 修饰剂上反应基团的活化方法与条件 要求有完善的方法 酶分子修饰的基本要求和条件 对酶分子进行修饰必须在修饰原理 修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解 1 酶的稳定性热稳定性 酸碱稳定性 作用温度 pH 抑制剂等 2 酶活性中心的状况活性中心基团 辅因子等 其他如分子大小 性状 亚基数等 酶分子修饰的条件 修饰反应尽可能在酶稳定条件下进行 并尽量不破坏酶活性功能的必需基团 使修饰率高 同时酶的活力回收高 1 pH与离子强度pH决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态 由于它们的解离状态不同 反应性能也不同 2 修饰反应的温度与时间严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应 3 反应体系中酶与修饰剂的比例 回本章目录 酶分子的修饰方法 酶分子的修饰方法 一 酶的表面化学修饰 一 大分子修饰 大分子结合修饰 是目前应用最广的酶分子修饰方法 1 定义 利用水溶性大分子与酶结合 使酶的空间结构发生某些精细的改变 从而改变酶的特性与功能的方法 酶分子的修饰方法 一 大分子修饰1 非共价修饰使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物 它们既能通过氢键固定在酶分子表面 也能通过氢键有效地与外部水相连 从而保护酶的活力 一些添加物 如多元醇 多糖 多聚氨基酸 多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力 另一类添加物就是蛋白质 蛋白质分子之间相互作用时 其表面区域内排除了水分子 因而增加了相互作用力 其稳定性也就增加了 酶分子的修饰方法 一 大分子修饰2 共价修饰用可溶性大分子 如聚乙二醇 右旋糖苷 肝素等 通过共价键连接于酶分子的表面 形成一层覆盖层 例如 用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 不仅可以降低或消除酶的抗原性 而且提高了抗蛋白酶的能力 延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效 大分子修饰 共价 的过程 修饰剂的活化 作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起 在使用之前一般需要经过活化 然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应 修饰 将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液 以一定的比例混合 在一定的温度 pH值等条件下反应一段时间 使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合 对酶分子进行修饰 分离 需要通过凝胶层析等方法进行分离 将具有不同修饰度的酶分子分开 从中获得具有较好修饰效果的修饰酶 酶分子的修饰方法 一 大分子修饰3 应用 如 PEG 超氧化物歧化酶 SOD PEG 溶血类蛋白质 链激酶 尿激酶等 PEG 天门冬酰胺酶 ASNase 消除了抗原性 延长了酶在体内的半衰期又如 用葡聚糖修饰 淀粉酶 淀粉酶 胰蛋白酶 过氧化氢酶 提高了酶的热稳定性 酶分子的修饰方法 二 小分子修饰 酶蛋白侧链基团修饰 1 定义通过选择性的试剂或亲和标记试剂与酶分子侧链上特定的功能基团发生化学反应 酶分子的修饰方法 二 小分子修饰侧链基团 组成蛋白质氨基酸残基上的功能团 主要有 氨基 羧基 胍基 巯基 酚基 咪唑基 1 侧链基团修饰剂 采用的各种小分子化合物 20种不同氨基酸的侧链基团中只有极性氨基酸的侧链易被修饰 它们一般具有亲核性 酶分子的修饰方法 二 小分子修饰1 侧链基团修饰根据氨基酸侧链R基的极性 20种氨基酸可分成4类 1 非极性R基氨基酸 共8种 丙氨酸 Ala 亮氨酸 Leu 缬氨酸 Val 异亮氨酸 Ile 苯丙氨酸 Phe 色氨酸 Trp 甲硫氨酸 Met 脯氨酸 Pro 酶分子的修饰方法 二 小分子修饰1 侧链基团修饰根据氨基酸侧链R基的极性 20种氨基酸可分成4类 2 无电荷的极性R基氨基酸 共7种 丝氨酸 Ser 苏氨酸 Thr 酪氨酸 Tyr 半胱氨酸 Cys 天冬酰胺 Asn 甘氨酸 Gly 谷氨酰胺 Gln 酶分子的修饰方法 二 小分子修饰1 侧链基团修饰根据氨基酸侧链R基的极性 20种氨基酸可分成4类 3 带正电荷的极性R基氨基酸 共3种 赖氨酸 Lys 精氨酸 Arg 组氨酸 His 酶分子的修饰方法 二 小分子修饰1 侧链基团修饰根据氨基酸侧链R基的极性 20种氨基酸可分成4类 4 带负电荷的极性R基氨基酸 共2种 天冬氨酸 Asp 谷氨酸 Glu 酶分子的修饰方法 二 小分子修饰1 侧链基团修饰 酶分子的修饰方法 二 小分子修饰1 侧链基团修饰1 烷基化反应试剂特点 烷基上带活泼卤素 导致酶分子的亲核基团 如 NH2 SH等 发生烷基化 可作用基团 氨基 Lys Arg 巯基 Cys 羧基 Asp Glu 甲硫基 Met 咪唑基 His 修饰剂 2 4 二硝基氟苯 碘乙酸 碘乙酰胺等 酶分子的修饰方法 二 小分子修饰1 侧链基团修饰1 烷基化反应 酶分子的修饰方法 二 小分子修饰1 侧链基团修饰2 酰基化反应试剂特点 含有结构 作用于侧链基团上的亲核基团 使之酰基化 可作用基团 氨基 巯基 醇羟基 Ser Thr 酚羟基 Tyr 酶分子的修饰方法 二 小分子修饰1 侧链基团修饰2 酰基化反应 酶分子的修饰方法 二 小分子修饰1 侧链基团修饰3 氧化和还原反应试剂特点 具有氧化性或还原性 氧化剂 H2O2 N 溴代琥珀酰亚胺可被氧化的侧链基团 巯基 甲硫基 吲哚基 Trp 咪唑基 酚基等 还原剂 2 巯基乙醇 DTT等 可被还原的侧链基团 二硫键 酶分子的修饰方法 二 小分子修饰2 侧链基团修饰3 氧化和还原反应 连四硫酸盐氧化巯基 DTT还原逆回 用于保护巯基 酶分子的修饰方法 二 小分子修饰2 特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰1 氨基的化学修饰 来源 Lys Arg His Gln修饰反应 酰基化与烷基化酰基化修饰剂 三硝基苯磺酸 TNBS 丹磺酰氯 DNS 烷基化修饰剂 2 4 二硝基氟苯 DNFB 碘乙酸 碘乙酰胺 亚硝酸等 酶分子的修饰方法 二 小分子修饰2 特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰2 羧基的化学修饰修饰羧基的反应专一性较差 常用水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸 可定量测定酶分子中羧基的数目 酶分子的修饰方法 二 小分子修饰1 侧链基团修饰4 芳香环取代反应试剂 卤 碘 化 硝化试剂 碘代 硝化 酶分子的修饰方法 二 小分子修饰2 特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰3 胍基的化学修饰来源 Arg修饰反应 本质上是羰基对氨基酰基化 修饰剂 丁二酮二羰基化合物1 2 环己二酮苯乙二醛 酶分子的修饰方法 二 小分子修饰2 特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰4 巯基的化学修饰来源 Cys修饰反应 烷基化修饰剂 碘乙酸 IAA 碘乙酰胺 IAM N 乙基马来酰亚胺 NEM 常用的专一修饰巯基试剂 E SH R X E SR HX 酶分子的修饰方法 二 小分子修饰2 特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰5 二硫键的化学修饰还原 巯基乙醇 二硫苏糖醇 DTT 酶分子的修饰方法 二 小分子修饰2 特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰6 咪唑基的化学修饰来源 His修饰反应 酰基化与烷基化酰基化修饰剂 常用焦碳酸二乙酯 酶分子的修饰方法 二 小分子修饰2 特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰6 咪唑基的化学修饰烷基化修饰剂 碘乙酸 酶分子的修饰方法 二 小分子修饰2 特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰7 酚羟基的化学修饰来源 Tyr修饰反应 芳香环取代反应修饰剂 碘 硝化试剂 四硝基甲烷 酶分子的修饰方法 二 小分子修饰2 特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰8 吲哚基的化学修饰来源 Trp修饰反应 氧化反应修饰剂 N 溴代琥珀酰亚胺 酶分子的修饰方法 一 酶的表面化学修饰交联修饰 交联法 用双功能基团试剂 如戊二醛 与酶分子内不同肽链部分共价交联 使酶分子空间构象更加稳定 固定化修饰 共价偶联法 通过酶表面的酸性或碱性残基 将酶共价连接到惰性载体上 由于酶所处的微环境发生改变 使酶的最适pH 最适温度和稳定性发生改变 酶分子的修饰方法 二 酶分子内部修饰 一 蛋白主链修饰 肽链有限水解修饰 蛋白主链修饰采用酶法 用专一性较强的蛋白酶或肽酶作为修饰剂 一 酶蛋白主链修饰 肽链有限水解修饰 利用酶分子主链的切断和连接 使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变 从而改变酶的特性和功能的方法 酶蛋白主链修饰主要是靠酶切 酶原激活法 a 胃蛋白酶原的激活 酶分子的修饰方法 二 酶分子内部修饰 一 蛋白主链修饰 肽链有限水解修饰 酶蛋白的肽链被水解后 可能出现以下三种情况中的一种 1引起酶活性中心的破坏 酶失去催化功能 2仍维持活性中心的完整构象 保持酶活力 3有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部位 酶活力提高 后两种情况 肽链的水解在限定的肽键上进行 称肽链有限水解 酶分子的修饰方法 二 酶分子内部修饰 二 金属离子置换修饰改变酶分子中所含的金属离子 使酶的特性和功能发生改变的方法 二 酶的金属离子置换修饰 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子 使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰 淀粉酶中的钙离子 Ca2 谷氨酸脱氢酶中的锌离子 Zn2 过氧化氢酶分子中的铁离子 Fe2 酰基氨基酸酶分子中的锌离子 Zn2 超氧化物歧化酶分子中的铜 锌离子 Cu2 Zn2 二 酶的金属离子置换修饰 若从酶分子中除去其所含的金属离子 酶往往会丧失其催化活性 如果重新加入原有的金属离子 酶的催化活性可以恢复或者部分恢复 若用另一种金属离子进行置换 则可使酶呈现出不同的特性 有的可以使酶的活性降低甚至丧失 有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性 金属离子置换修饰的过程 a 酶的分离纯化 首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化 除去杂质 获得具有一定纯度的酶液 b 除去原有的金属离子 在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂 如乙二胺四乙酸 EDTA 等 使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物 通过透析 超滤 分子筛层析等方法 将EDTA 金属螯合物从酶液中除去 此时 酶往往成为无活性状态 c 加入置换离子 于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子 酶蛋白与新加入的金属离子结合 除去多余的置换离子 就可以得到经过金属离子置换后的酶 金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶 用于金属离子置换修饰的金属离子 一般都是二价金属离子 氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法 例如 Bender等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸 修饰后 该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力 却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性 但是化学修饰法难度大 成本高 专一性差 而且要对酶分子逐个进行修饰 操作复杂 难以工业化生产 现在常用的氨基酸置换修饰的方法是定点突变技术 定点突变 sitedirectedmutagenesis 是20世纪80年代发展起来的一种基因操作技术 是指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术 是蛋白质工程 ProteinEngineering 和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术 定点突变技术 为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进 可靠 行之有效的手段 三 氨基酸置换修饰 酶分子的定点突变 1 基因序列分析2 蛋白质结构分析3 酶活性中心分析4 引物设计进行基因定点突变5 酶基因克隆表达6 变异特性分析 酶修饰后的性质变化 热稳定性 一般来说 热稳定性有较大的提高 抗原性 比较公认的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显 各类失活因子的抵抗力 修饰酶对蛋白酶 抑制剂均有一定的抵抗能力 从而提高其稳定性 半衰期 一般在体内的半衰期得到有效延长 由于酶分子经修饰后 增强对热 蛋白酶 抑制剂等的稳定性 从而延长了在体内的半衰期 最适pH 大部分酶经化学修饰后 酶的最适pH发生了变化 这种变化在应用研究上有时具有重要意义 修饰酶最适pH更接近于生理环境 在临床应用上有较大意义 Km的变化 大多数酶经修饰后 Vm没有明显变化 但有些酶经修饰后 Km值变大 回本章目录 二 酶的定向进化 定向进化概念的提出1993年 美国科学家ArnoldFH首先提出酶分子的定向进化的概念 并用于天然酶的改造或构建新的非天然酶 二 酶的定向进化 概念人为地创造特殊的进化条件 模拟自然进化机制 在体外对基因进行随机突变 从一个或多个已经存在的亲本酶 天然的或者人为获得的 出发 经过基因的突变和重组 构建一个人工突变酶库 通过一定的筛选或选择方法最终获得预先期望的具有某些特性的进化酶 定向进化 随机突变 选择 定向进化的原理 在待进化酶基因的PCR扩增反应中 利用TaqDNA聚合酶不具有3 5 校对功能的性质 配合适当条件 以很低的比率向目的基因中随机引入突变 构建突变库 凭借定向的选择方法 选出所需性质的优化酶 或蛋白质 从而排除其他突变体 定向进化的基本规则是 获取你所筛选的突变体 定向进化 随机突变 选择 前者是人为引发的 后者虽相当于环境 但只作用于突变后的分子群 起着选择某一方向的进化而排除其他方向突变的作用 整个进化过程完全是在人为控制下进行的 二 酶的定向进化 酶分子的合理设计 rationaldesign 酶分子的定向进化 directedevolution 酶的合理设计 体外定向进化的意义 理论上 蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力 很多功能有待于开发 这是酶的体外定向进化的基本先决条件 所谓酶的体外定向进化 又称实验分子进化 属于蛋白质的非合理设计 它不需事先了解酶的空间结构和催化机制 通过人为地创造特殊的条件 模拟自然进化机制 随机突变 重组和自然选择 在体外改造酶基因 并定向选择出所需性质的突变酶 酶的体外定向进化技术极大地拓展了蛋白质工程学的研究和应用范围 特别是能够解决合理设计所不能解决的问题 为酶的结构与功能研究开辟了崭新的途径 并且正在工业 农业和医药等领域逐渐显示其生命力 二 酶的定向进化 随机突变的策略易错PCR技术 error pronePCR DNA改组 DNAshuflling 由美国Stemmer于1994年首次提出一项体外重组技术随机引发重组 RPR 1998年 Arnold提出了一种有效的新方法交错延伸技术 StEP 由Zhao等提出 是一种简化的DNAshuffling技术 二 酶的定向进化 易错PCR易错PCR errorpronePCR 是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配 导致目的基因随机突变 连续易错PCR sequentialerrorpronePCR 策略 即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板 连续反复地进行随机诱变 DNA改组和外显子改组 DNA改组 DNAshuffling 又称有性PCR sexualPCR 原理 该策略的目的是创造将亲本基因群中的突变尽可能组合的机会 导致更大的变异 最终获取最佳突变组合的酶 通过DNA改组 不仅可加速积累有益突变 而且可使酶的2个或更多的已优化性质合为一体 外显子改组 exonshuffling 类似于DNA改组 两者都是在各自含突变的片段间进行交换 前者尤其适用于真核生物 在自然界中 不同分子的内含子间发生同源重组 导致不同外显子的结合 是产生新蛋白质的有效途径之一 与DNA改组不同 外显子改组是靠同一种分子间内含子的同源性带动 而DNA改组不受任何限制 发生在整个基因片段上 DNA改组原理 二 酶的定向进化 体外随机引发重组体外随机引发重组 randompriminginvitrorecombination RP