第十一章 质谱技术在蛋白质多肽化学.ppt

第十一章质谱技术在蛋白质 多肽化学中的应用 第一节蛋白质 多肽质谱技术的发展第二节蛋白质 多肽质谱技术介绍第三节质谱在蛋白质 多肽分析中的应用 第一节蛋白质 多肽质谱技术的发展 一 基本原理 质谱分析法 massspectrometry 是将化合物形成离子和碎片离子 按其质荷比 值 的不同进行分离测定 来进行成分和结构分析的一种分析方法 蛋白质 多肽质谱是通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子 然后利用质谱分析仪的电场 磁场将具有特定质量与电荷比值 值 的蛋白质离子分离开来 经过离子检测器收集分离的离子 确定离子的 值 分析鉴定未知蛋白质 蛋白质 多肽质谱发展史 20世纪60年代科学家们曾注意到质谱技术在蛋白质和肽的结构分析中存在的潜力 但由于离子化技术的限制 近30年来 质谱技术只在有机化合物小分子的结构测定中得到应用 而对于大分子 分子量超过1000Da 极性分子和难气化的分子 则显得无能为力 70年代Macfarlane等人发明了一种叫等离子体解吸 Plasmadesorption PD 的离子化技术 使得质谱测定分子量范围扩大到几千道尔顿 80年代初Barber等人又引入了快原子轰击 fastatombombardment 简称FAB 电离技术 并成功地测定了一个26肽的结构 从而使得质谱技术应用于蛋白质和肽的结构测定这一设想变为现实 80年代末两种更新的技术得到发展 它们分别是JohnFenn发明的电喷雾电离 electrosprayionization ESI 和Hillenkamp等人发明的基质辅助的激光解吸电离 matrixassistedlaserdesorptionionization MALDI 这两种技术解决了极性大 热不稳定的蛋白质 多肽分子的离子化和大分子量的测定问题 另外 这两种质谱无论在灵敏度 准确性和在分析混合物的复杂性方面都比以前的技术有了显著的改善 从而大大拓宽了质谱技术在蛋白质领域中的应用 可以说是质谱技术在生物大分子中应用的一场革命 第二节蛋白质 多肽质谱技术介绍 蛋白质 多肽质谱质谱技术介绍 质谱仪组成离子源质量分析器检测器串联质谱及联用技术 质谱仪组成 质谱仪一般由四部分组成 进样系统 按电离方式的需要 将样品送入离子源的适当部位 离子源 用来使样品分子电离生成离子 并使生成的离子会聚成有一定能量和几何形状的离子束 质量分析器 利用电磁场 包括磁场 磁场和电场的组合 高频电场 和高频脉冲电场等 的作用将来自离子源的离子束中不同质荷比的离子按空间位置 时间先后或运动轨道稳定与否等形式进行分离 检测器 用来接受 检测和记录被分离后的离子信号 质谱仪组成 计算机数据处理系统 真空系统 加速区 进样系统 离子源 质量分析器 检测器 Ionisationsource Ionseparation Detector Output 离子源 离子源的功能是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子 由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大 因此 对于不同的分子应选择不同的离解方法 通常称能给样品较大能量的电离方法为硬电离方法 而给样品较小能量的电离方法为软电离方法 后一种方法适用于易破裂或易电离的样品 离子源 离子源是质谱仪的心脏 可以将离子源看作是比较高级的反应器 其中样品发生一系列的特征降解反应 分解作用在很短时间 1 s 内发生 所以可以快速获得质谱 离子化的方法 电子轰击电离ElectronImpactIonization EI化学离子化ChemicalIonization CI场电离 场解吸FieldIonizationFD FieldDesorptionFD快原子轰击FastAtomBombardment FAB电喷雾电离ElectrosprayIonization ESI基质辅助激光解析电离Matrix AssistedLaserDesorptionIonization MALDI大气压化学电离AtmosphericPressureChemicalIonization APCI 离子化的方法 根据不同的离子化方法 常用的适用于蛋白质 多肽研究的质谱技术方法包括FAB MS ESI MS MALDI TOF MS等 而其中又以MALDI MS和ESI MS应用最为广泛 这两个新技术明显增加了质谱范围和敏感度 从而导致了新的软件和检测器的发展 FAB MS 直到80年代FAB质谱问世 质谱技术才真正推广到蛋白质领域 它是一种用快速原子轰击被分散在高沸点溶剂 如甘油 中的待测化合物 从而产生分子离子 快原子的产生是通过电离隋性气体Ar Xe或He产生的Ar Xe 或He 被电场加速 从而具有较大动能 以后通过Ar气室进行电荷交换反应 Ar 高动能的 Ar 热运动的 Ar 高动能的 Ar 热运动的 经电荷交换后的低动能 热 的Ar 被偏转出快原子流 获得高动能快速的Ar原子对样品分子进行轰击 一般样品调在甘油基质之中 当快原子束轰击在涂有样品的金属板上 快原子大量动能以各种方式消散 其中的一些能量导致样品的挥发和离解 FAB MS FAB MS特点 这种方法要求简单 灵敏较高 FAB产生的分子离子非常稳定 不易裂解 是准确测定多肽化合物分子量的有效方法 应用于一些较复杂的混合物 能测出其各组份的分子量 当然由于不易获得碎片峰 FAB质谱在测定多肽顺序时遇到困难 ESI MS 电喷雾离子化技术 electrosprayionization ESI 利用强静电场从溶液直接产生气态离子化分子 ESI可以与液相色谱 高效液相色谱 毛细管IEF以及毛细管电泳等多种进样器联用 流出液在高电场下形成带电喷雾 在电场力作用下穿过气帘 ESI MS ESI MS ESI一般分为正离子ESI和负离子ESI两类 正离子ESI的原理 在一个金属喷嘴的针尖上加有2 5 6kV高电压 经强电场作用 样品溶液从针尖小孔喷出 成为一个个带正电的液滴 在迎面吹来的热氯气流的作用下 液滴表面溶剂蒸发 液滴变小 液滴的电荷密度骤增 当静电排斥力等于液滴的表面张力时 液滴便发生崩解 形成更小的液滴 如此形成的小液滴以类似的方式继续崩解 于是 液滴中的溶剂迅速蒸干 产生多电荷正离子 在质谱仪内被分析纪录 负离子EIS的过程与此类似 唯电性相反 ESI MS RayleighLimitReached ChargedDroplets 试样离子 准分子离子 其他离子 ESI MS 这种分子离子特点是分子离子往往带多个电荷 这些离子的形成是靠吸附上或失去若干个质子而形成 所以在正离子或负离子谱上会观察到 M nH n 或 M nH n 的峰 对于生物大分子 在ESI谱上出来的往往是一组带不同电荷的分子离子峰 根据仪器上记录下来的每个峰的质荷比及电荷数即可算出分子量值 实际上从一组峰上可算出无数个分子量值 它们相互之间会略有差别 一般需在计算机上经特定的程序处理 找出最接近实际的分子量值 ESI MS特点 优点 解决了极性大 热不稳定的蛋白质与多肽分子的离子化和大分子质量 一级结构和共价修饰位点的测定问题 并可用于研究DNA与药物 金属离子 蛋白质和抗原与抗体的相互作用 缺点 样品中的盐类对样品结果影响很大 而且单个分子带电荷不同可形成多种离子分子峰 重叠峰 所以对混合物的图谱解析比较困难 MALDI MS 基质辅助的激光解析电离 matrix assistedlaserdesorptionionization MALDI 技术产生的离子常用飞行时间 time off flight TOF 检测器来检测 所以MALDI名字常与TOF联在一起 即叫基质辅助的激光解析飞行时间质谱仪 MALDI TOF MS 简而言之 基质辅助激光解吸电离 飞行时间质谱测量仪是将多肽成分转换成离子信号 并依据质量 电荷之比 m z 来对该多肽进行分析 以判断该多肽源自哪一个蛋白 MALDI MS 待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团的化学基质 matrix 混合 此样品混合物随即滴于一平板或载玻片上进行挥发 样品混合物残余水份和溶剂的挥发使样品整合于格状晶体中 样品然后置于激光离子发生器 lasersource 激光作用于样品混合物 使化学基质吸收光子而被激活 此激活产生的能量作用于多肽 使之由固态样品混合物变成气态 MALDI TOF MS 由于多肽分子倾向于吸收单一光子 故多肽离子带单一电荷 这些形成的多肽离子直接进入飞行时间质量分析仪 TOFmassanalyzer 飞行时间质量分析仪用于测量多肽离子由分析仪的一端飞抵另一端探测器所需要的时间 而此飞行时间同多肽离子的质量 电荷的比值成反比 即质量 电荷之比越高 飞行时间越短TOF质量分析器被认为是与MALDI的最佳搭配 MALDI TOF MS MALDI MS特点 对于一些分子量较大 1000000Da 或疏水性强的蛋白质 MALDI比ESI更有效 MALDI能有效地分析较复杂的肽混合物或物理化学性质相差较大的蛋白质混合物 只要能与所选择的底物形成稳定的分散体系的样品都能用MALDI进行分析 MALDI不受样品所含的添加物 缓冲液或盐的影响 且灵敏度也比别的离子化方式高 软电离 ESI和MALDI这两种 软电离 技术解决了极性大 热不稳定的蛋白质的离子化和大分子生物的分子质量的测定问题 而且 这两种方法在灵敏度 准确度和分析混合物的复杂性方面都比以前的质谱技术有了显著的改善 生物质谱两种主要电离方法比较 质量分析器 质量分析器将带电离子根据其质荷比加以分离 用于纪录各种离子的质量数和丰度 质量分析器的两个主要技术参数是所能测定的质荷比的范围 质量范围 和分辨率 扇形磁分析器四极杆分析器离子阱分析器飞行时间分析器傅里叶变换分析器 扇形磁分析器 不同质荷比的离子在磁场的作用下 前进方向产生不同的偏转 从而使离子束发散 由于不同质荷比的离子在扇形磁场中有其特有的运动曲率半径 通过改变磁场强度 检测依次通过狭缝出口的离子 从而实现离子的空间分离 形成质谱 四极杆分析器 离子束在与棒状电极平行的轴上聚焦 一个直流固定电压 DC 和一个射频电压 RF 作用在棒状电极上 两对电极之间的电位相反 对于给定的直流和射频电压 特定质荷比的离子在轴向稳定运动 其他质荷比的离子则与电极碰撞湮灭 离子阱分析器 由两个端盖电极和位于它们之间的类似四极杆的环电极构成 端盖电极施加直流电压或接地 环电极施加射频电压 RF 通过施加适当电压就可以形成一个势能阱 离子阱 根据RF电压的大小 离子阱就可捕获某一质量范围的离子 离子阱可以储存离子 待离子累积到一定数量后 升高环电极上的RF电压 离子按质量从高到低的次序依次离开离子阱 被电子倍增监测器检测 飞行时间分析器 有相同动能 不同质量的离子 因其飞行速度不同而分离 如果固定离子飞行距离 则不同质量离子的飞行时间不同 质量小的离子飞行时间短而首先到达检测器 各种离子的飞行时间与质荷比的平方根成正比 TOF分析器特点 TOF质量分析器结果简单 容易换算 蛋白质离子在飞行管内的飞行速度仅与他的 m z 1 2成正比 因此容易通过计算蛋白质离子在飞行管内的飞行时间推算出蛋白质离子的m z值 与传统质量分析器相比 更易得到高分辨率和高测量精度 速度快 离子飞行时间仅为几个 s和约100 s之间 质量范围宽 可以直接检测到几十万道尔顿的单电荷离子 飞行时间质量分析器被认为是21世纪最有应用前景的质量分析器 傅里叶变换分析器 在一定强度的磁场中 离子做圆周运动 离子运行轨道受共振变换电场限制 当变换电场频率和回旋频率相同时 离子稳定加速 运动轨道半径越来越大 动能也越来越大 当电场消失时 沿轨道飞行的离子在电极上产生交变电流 对信号频率进行分析可得出离子质量 将时间与相应的频率谱利用计算机经过傅里叶变换形成质谱 其优点为分辨率很高 质荷比可以精确到千分之一道尔顿 检测器 具有特定m z值的离子通过质量分析器打在检测器上 在检测器上产生的放大电流可以作为时间函数用来测定离子强度 丰度 和m z 离子源产生的离子的相对强度可以由检测器测量 其结果通常以m z值作为横坐标 离子相对丰度为纵坐标的形式表示 检测器 质谱一般可以用两种形式表示 一种是以规一化 nomalized 的或者相对丰度 RA 的形式来表述 另一种是以总离子流的百分数 TIC 来描述 在规一化的质谱中 最高的峰 largestpeak 例如最丰富的离子 并不一定是所要研究的分析物 被称为基峰 basepeak 其高度规定为100单位 谱中的其他峰的相对高度都根据这个峰进行规一化 一次它们的相对高度就介于0 100单位之间 串联质谱 两个或更多的质谱连接在一起 称为串联质谱 最简单的串联质谱 MS MS 由两个质谱串联而成 其中第一个质量分析器 MS1 将离子预分离或加能量修饰 由第二级质量分析器 MS2 分析结果 TandemMSorMS MShas2massspectrometersinseries MS1 MS2 串联质谱 MS MS最基本的功能包括能说明MS1中的母离子和MS2中的子离子间的联系 根据MS1和MS2的扫描模式 如子离子扫描 母离子扫描和中性碎片丢失扫描 可以查明不同质量数离子间的关系 最常用的就是将一级质谱的分子离子 图谱称MS1 和惰性原子再一次轰击低能碰撞诱导断裂 low energycollision induceddissociation CID或称碰撞辅助断裂 col1isionallyassisteddissociation CAD 从而获得一张碎片图谱 MS2 三级四级质谱仪四种MS MS工作方式 联用技术 色谱可作为质谱的样品导入装置 并对样品进行初步分离纯化 因此色谱 质谱联用技术可对复杂体系进行分离分析 因为色谱可得到化合物的保留时间 质谱可给出化合物的分子量和结构信息 故对复杂体系或混合物中化合物的鉴别和测定非常有效 气相色谱 质谱联用 GC MS 气相色谱的流出物已经是气相状态 可直接导入质谱 由于气相色谱与质谱的工作压力相差几个数量级 开始联用时在它们之间使用了各种气体分离器以解决工作压力的差异 随着毛细管气相色谱的应用和高速真空泵的使用 现在气相色谱流出物已可直接导入质谱 液相色谱 质谱联用 LC MS 液相色谱 质谱联用的接口前已论及 主要用于分析GC MS不能分析 或热稳定性差 强极性和高分子量的物质 如生物样品 药物与其代谢产物 和生物大分子 肽 蛋白 核酸和多糖 在蛋白测序方面 LC MS MS得到了广泛的应用 LC MS MS 其他联用技术 毛细管电泳 质谱联用 CE MS 芯片 质谱联用 Chip MS 超临界流体色谱 质谱联用 SFC MS 等离子体发射光谱 质谱联用 ICP MS 第三节质谱在蛋白质 多肽分析中的应用 质谱在蛋白质 多肽分析中的应用 分子量的测定蛋白质 多肽纯度的鉴定肽质量指纹谱肽序列测定技术蛋白质的翻译后修饰鉴定其他 蛋白质鉴定 分子量的测定 用ESI MS和MALDI TOF MS测定蛋白质和多肽的分子量 精确度可达0 1 0 01 这远比其它方法 如SDS PAGE 凝胶过滤 超离心等 精确 正确测定蛋白质的分子量 可以提供很多信息 如确定分子大小 从氨基酸组成分析的结果求得准确的氨基酸组成 验证已测定的一级结构是否正确等 分子量测定实例 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳 高效凝胶过滤色谱以及电喷雾离子化质谱三种方法对新发现的一种蛋白质 来源于福建尖吻蝮蛇蛇毒 是一种具有类凝血酶活性的弱酸性蛋白质 的分子量进行了测定 分子量测定实例 天花粉蛋白的一级结构测定 在86年时曾出现差错 当时测定的结果表明它是由234个氨基酸残基组成 分子量为25682Da 90年 我们发现结构测定有误 重新修正了其一级结构 它应由247个氨基酸残基组成 正确分子量为27141 32Da 93年 用MALDL TOF MS和ESI MS测定了天花粉的分子量 天花粉蛋白 TCS 的MALDI TOF MS的分子量图谱 天花粉蛋白 TCS 的ESI MS的分子量图谱 分子量测定实例 苦瓜子蛋白的一级结构计算 包括糖部分 的分子量为29156Da 用MALDI TOF MS测定的分子量为29074Da 二者相差82Da 这种差异可能是个别氨基酸测定的差错造成 估计整个结构测定不会有大错误 分子量测定实例 苦瓜子蛋白其C端用羧肽酶的方法测定为 S T A D E N 但尚不能完全确定 苦瓜子蛋白在190位有一个色氨酸 我们用BNPS Skatole降解色氨酸 降解后的肽用HPLC分离 得到含有C端的一段小肽 59个氨基酸残基 用MALDI TOF MS测定其分子量为6443与计算得到的59肽的分子量为6442 9非常相符 因此也就证明了C端59个氨基酸残基的顺序是正确的 苦瓜子蛋白Trp降解C端肽分子量 蛋白质 多肽纯度的鉴定 根据质谱测定分子量的作用 质谱还可用来作蛋白质 多肽纯度的鉴定 只要质量有差异的杂质都可以被检出 此方法灵敏度高 用量少 pmol水平 速度快 并有独到之处 蛋白质 多肽纯度的鉴定 实例1 天花粉蛋白C 端微观不均一 即有二个C末端 一个多一个Ala 即247个氨基酸残基 一个少一个Ala 即246个氨基酸残基 用ESI MS完全能够分辨出来 实例2 如猪胰岛素和人胰岛素混在一起 用MALDI TOF MS也能够清楚地分出二个峰 两者的差异仅在猪胰岛素B链的第30位为Ala 89 09Da 而人胰岛素相应的位置为Thr 119 12Da 两者相差30Da 如图13 11 这些差异用其他方法是很难检出的 蛋白质鉴定 肽质量指纹谱 基于串联质谱多肽测序蛋白质鉴定 肽质量指纹谱 由于各种蛋白质的氨基酸序列 一级结构 不同 蛋白质被酶解后产生的肽段序列也各异 肽混合物质量数亦具特征性 称为肽质量指纹谱 peptidemassfingerprint PMF 可用于蛋白质的鉴定 PMF流程 肽质量指纹谱 MALDI TOF MS是最有效的分析肽混合物的质谱仪 肽混合物不需分离可直接分析 基质辅助激光电离方法能耐受一定浓度的盐 仪器灵敏度高 标准样品1pmol的量就足够 质量数准确度可达0 1 0 01 且操作简单 分析速度快 依仪器型号不同一次可分析十几个到几十个样品 PMF实例 蓖麻毒素 ricin 利用MALDI TOF生物质谱技术结合肽质量指纹谱方法 经过数据库检索 建立了鉴定检测Ricin的新方法 MALDI TOF质谱的测定 得到Ricin的分子量为62925Da Ricin的肽质量指纹谱 共检出22条肽谱峰 将这些肽片段的质谱数据用MASCOT搜索引擎在SwissProt数据库中进行PMF检索 检索参数如表1所示 返回前5个检索结果 如表2所示 其中符合要求的结果 置信区间为得分大于66分 只有一种蛋白即蓖麻毒素 Ricinprecursor P02879 RICI RICCO 得分107 匹配肽段13条 肽谱的实验值与理论值的对比见表3 其余未检出的肽段中有4条经过与理论值对照也找到了归属 肽序列测定技术 两种经典测序方法 DNA顺序测定解决不了翻译后加工所导致的氨基酸残基的修饰的问题 Edman降解不能解决N端封闭的测序的问题 蛋白梯形测序 proteinladdersequencing 使用少量链终止剂 进行快速分步降解 在人为控制下产生一系列肽段 其中每个肽段于下一个之间只相差一个残基 用MALDI TOF MS读出肽段信息 用此方法可在磷酸肽中定位磷酸丝氨酸残基 研究N 端封闭的肽和蛋白 必须了解其C 端序列的信息 蛋白梯形测序 proteinladdersequencing 肽测序一般方法 MS MS 使用串联质谱 利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子 通过分析相邻同组类型峰的质量差 识别相应的氨基酸残基 其中亚稳离子碎裂包括 自身 碎裂及外界作用诱导碎裂 基于串联质谱的肽序列测定 用特定蛋白水解酶作用于蛋白质 将得到的肽段送入一级质谱 产生前体离子 经过一定选择的前体离子在碰撞室发生CID 结果是前体离子肽骨架酰胺键的特异性断裂 并产生了一系列可用于确定氨基酸序列的y型和b型等离子 获得CID二级质谱图后可算出肽序列 经过MS MS分析的多肽片段 N端和C端多肽 G F P N A G F P N A G F P N A G F P N A G F P N A N terminalpeptides C terminalpeptides 415 486 301 154 57 71 185 332 429 理论质谱图 理论质谱图与实际质谱图 理论质谱图与实际质谱图 标准肽Glu fib的MS MS图谱 MS MS优点 MS MS质谱测序可对N端封闭的肽进行测序 并可以通过CID得到部分至完全的序列信息后 做出MS肽谱 这可对修饰的氨基酸残基定性 并确证其位置 包括二硫键的分布 而且质谱技术与分离技术直接相连也可相互验证 同时还可对混合肽进行测序 另外它还有快速 灵敏的优点 基于MS MS蛋白质鉴定 获得二级质谱图后可通过下列方法鉴定蛋白质 较常用的肽序列标签鉴定方法 peptidesequencetag PST 从一级质谱产生的肽段中选择母离子 进入二级质谱 经惰性气体碰撞后肽段沿肽链断裂 由所得到的各肽段质量数差值推定肽段序列 用于数据库查寻 肽碎片离子搜索 直接用前体离子产生的未解析的CID图谱与数据库中的CID图谱比较 如Sequest Mascot Sonat等算法 从头测序法 denovosequence 通过直接解释MS MS数据识别肽序列 这类系统和算法有Lutefisk SHERENG PEAKS AuDeNS等 基于MS MS的蛋白质鉴定 串联质谱在蛋白质组学中的应用 测序其它方法 先用几种不同的蛋白水解酶对蛋白质进行酶解 胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶嗜热菌蛋白酶 thermolysin SV8酶 staphylococcusaureusV8 各种酶解片段用HPLC等分离得到的纯肽或简单的混合肽 可用MS MS测定其各组分的顺序 然后从不同蛋白水解酶酶解片段顺序 找到其重叠部分 即可得到整个蛋白质顺序 蛋白质的翻译后修饰鉴定 磷酸化修饰糖基化修饰巯基和二硫键定位氨基的乙酰化泛素化修饰 磷酸化修饰 已知的磷酰氨基酸的类型有四种 1 O 磷酸盐 通过羟氨酸的磷酸化形成的 如丝氨酸 苏氨酸 酪氨酸 2 N 磷酸盐 通过精氨酸 赖氨酸或组氨酸中的氨基的磷酸化形成的 3 乙酰磷酸盐 通过天冬氨酸或谷氨酸的磷酸化形成的 4 S 磷酸酯 通过半胱氨酸的磷酸化形成的 磷酸化肽富集 分离技术有 双向磷酸多肽谱图 2D PP 高分辨率的凝胶电泳 2DE 和反相高效液相色谱 RP HPLC 对于32P标记的磷酸化肽或蛋白可用放射自显影或磷储屏检测 提取后可以高灵敏度MALDI MS分析 如果32P标记不可行 就要用LC MS MS分析 常用HPLC与质谱联用 常用的富集方法有 固定金属亲和色谱 IMAC 抗体免疫沉淀 化学修饰 质谱检测磷酸化肽和确定磷酸化位点的方法 MALDI TOF MS可以通过肽指纹谱 PMF 鉴定蛋白质 与磷酸酯酶处理相结合可以确定磷酸化位点 原理 磷酸酯酶处理后 磷酸化的肽丢失磷酸基团而产生特定质量数的变化 MALDI TOF MS通过检测这种质量数的变化而确定磷酸化位点 串联质谱 MS MS 进行前体离子扫描 这一方法是通过检测磷酸基团产生的特定片段来报告磷酸肽的存在 原理 磷酸化肽经CID后会产生磷酸基团的特异性片段 这些特异性的片段在用串联质谱进行前体离子扫描时可作为磷酸肽的 报告离子 质谱检测磷酸化肽和确定磷酸化位点的方法 串联质谱还可进行中性丢失扫描 这种方法是用MS MS检测经CID后发生中性丢失H3PO4 98u 的肽段 LC MS MS分析磷酸化位点傅立叶变换质谱进行电子捕获解离 质谱检测磷酸化肽和确定磷酸化位点的方法 糖基化修饰 蛋白质糖基化可分为4类 N 糖基化O 糖基化C 甘露糖化聚糖磷脂酰肌醇锚 GPI anchor 糖基化 糖蛋白结构分析示意图 糖基化位点确定 先用蛋白酶将糖蛋白酶解成含有和不含有糖链的肽片段 获得糖蛋白的肽质量指纹谱 再用糖苷内切酶将肽链切除 PMF发生变化 原含有糖肽段的质量由于糖链的丢失在质谱图上发生位移 通过网上数据库检索可以得到位移肽片段的氨基酸序列 而在这个序列中必含有糖基化位点 由此我们可以确定糖蛋白分子中的糖基化位点 糖基化分析 用糖苷内切酶将糖链切除 将反应前后的质谱图进行比较 就能直接表述糖链的平均质量 而糖蛋白的平均含糖量可由糖链的平均质量占糖蛋白平均相对分子质量的百分比来表示 应用ESI 对PMF中的肽片段进行