Westernblot所需溶液的配制.doc

. WB所需溶液的配制1 Tris-甘氨酸电泳缓冲液 (Running buffer) 5Tris base15.14gGlycine(甘氨酸)72.0gSDS5.0g蒸馏水溶解至1000ml5Tris-甘氨酸电泳缓冲液：15.1g Tris碱和72甘氨酸，5电泳级的SDS，双蒸水定容至1L，pH值为8.3。使用前，将5稀释到1：取200ml 5，定容到1000ml。2 转膜缓冲液 （Sending buffer）（现用现配）1000 ml1500 mlGlycine(甘氨酸)14.413 g21.6 g1.0 M Tris.HCl (pH8.3)25 ml37.5ml10% SDS1 ml1.5 ml甲醇 (methanol)200 ml300 ml蒸馏水溶解至1000 ml溶解至1500 ml必须新鲜配置，因为甘氨酸溶于水后易分解。小片段可不加SDS。3 10% SDS配置电泳级十二烷基硫酸钠也叫SDS（Sodium Dodecyl Sulfate ，SDS,C12H25O4NaS）溶液: 10g SDS，100ml去离子水配制，50-68度搅拌溶解，浓盐酸调pH到7.2，室温保存。4 Tris.HCl的配置1.0M Tris.HCl (pH8.8)Tris 30.28 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到8.81.5 M Tris.HCl (pH8.8)Tris 45.43 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到8.81.0 M Tris.HCl (pH6.8)Tris 30.28 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到6.81.0 M Tris.HCl (pH8.3)Tris 30.28 g 加入到250ml水中浓盐酸调pH到8.3，需要大约8毫升。注：Tris的分子量是121.4. 4度储存。5 10% APS (Ammonium persulfate ; 过硫酸铵)的配置称取1g过硫酸铵，加超纯水溶解并定容至10ml，分装到1.5ml微量离心管中，负30度冻存。使用时尽量现配现用，短期内实验频繁可多配。4度存则两周内用完，最多不能超过一个月。负20度可存两个月，但一旦解冻后尽快用完。6 10TBS (Tris-buffered saline)的配置NaCl80 g160 gTris base24 g48 g双蒸水溶解至1000 ml溶解至2000 ml加HCl调pH到7.6，室温储存。7 TBST (Tris-buffered saline with Tween20) 的配置10TBS100 ml200 mlTween201 ml2 ml双蒸水溶解至1000 ml溶解至2000 ml室温储存。8 上样缓冲液（loading buffer）的配置SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100g。9 stacking gel buffer (4)Tris base: 0.5M5 ml 1M Tris.HClSDS(w/v): 0.4%0.4ml 1%SDS调pH到6.8，加双蒸水到10毫升。10 5Sample buffer (10ml)Stacking gel buffer5 mlSDS1.0 g巯基乙醇2.5 ml（最后再加）甘油（glycerol）2.5 ml溴芬兰（Sigma B-8026）2.5 mg室温储存11 封闭液的配置 Blocking solution 要用TBST配制牛奶5% (w/v) nonfat dried milk 或者1%BSA0.01% antifoam A (Sigma)0.01%(v/v) sodium azide12 丽春红溶液：100微升冰醋酸，加入0.05克丽春红，用水稀释至10毫升。1） 4%多聚甲醛（PFA）的配制 （1000毫升）40克多聚甲醛，加入800毫升水，60度搅拌溶解，加入300微升氢氧化钠，全部溶解后冷却到4度，再加入100毫升的10PBS，加水定容到1000毫升。调pH到7.2-7.4。通风橱过滤，4度保存。13 组织裂解液10mM Tris- HCl (pH 7.4)48.44mg 粉末或1M Tris- HCl 0.4ml150mM NaCl350.6 mg1% TritonX-1000.4 ml 100%1% 去氧胆酸钠（Sodium dexycholate）400 mg5mM EDTA74.4 mg 或0.25M EDTA 3.2 ml1% SDS10% SDS 0.4 mlPMSF (难溶解)7 mg蛋白酶抑制剂1片/10ml步骤：首先加10-20毫升的水溶解EDTA,再加入0.2%NaOH使溶解，再调pH至 7.4；然后分别加入其他成分，溶解一个再加另外一个；去氧胆酸钠开盖后会飞出，应戴