植物花粉和花药培养.ppt

第五章花药和花粉培养 植物组织培养 第五章花药和花粉培养 本章主要内容 花粉和花药培养的概念和应用花粉小孢子发育途径花粉和花药培养方法单倍体植株鉴定和染色体加倍 第5章花药和花粉培养 第一节花粉和花药培养的概念和应用 花粉和花药培养的概念花药和花粉培养的历史花粉和花药培养的应用 花粉和花药的培养 pollenandantherculture 是指在人工合成培养基上 改变花粉的发育途径 使其不形成配子 而像体细胞一样进行分裂 分化 由单个花粉粒发育成完整单倍体植株的技术 第5章花药和花粉培养 单倍体植物 haplobiont 用离体培养花药的方法使花粉发育成一个完整的植株 花药培养 花粉培养 胚珠或子房培养 未受精 一 概念 第5章花药和花粉培养 异同点 相同点 二者培养的目的一样 都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞 最后发育成单倍体植株 不同点 花药培养属器官培养 花药是植物花的雄性器官 包括体细胞性质的药壁和药隔组织 以及雄性性细胞的花粉粒花粉培养属细胞培养 花粉培养没有药壁组织干扰 可计数小孢子产胚率 可观察雄核发育的全过程 单倍体产量高 但技术更复杂 比花药培养难度大 二 植物花药 花粉培养历史 Guha和Maheshwari 1964 曼陀罗花药培养Nitsch和Norreel 1973 烟草花粉培养 游离小孢子培养 Chu 1973 小麦花粉培养 早期花药培养主要依靠小孢子的自然胚胎发生产生单倍体 能自发形成胚胎发生的基因频率较低 效率极低 80年代后期到90年代期间 花培技术迅速发展 许多作物小孢子培养已经成功 十字花科 麦类 水稻 玉米等 90年代 一些先前被认为是不易进行小孢子培养的基因型也相续成功Konzak 1999 通过花药培养育成的甜椒新品种 海花三号 三 花药和花粉培养的应用 1 诱导形成单倍体 快速获得纯系 缩短育种周期 第5章花药和花粉培养 常规育种需4 6年获得纯系 而小孢子培养仅需一年 1 作物育种 常规育种在杂交F5 F6代开始选择 花药培养在F1或F2代进行培养 再人工加倍处理 缩短育种周期3 5年克服后代分离 大大缩短育种周期 第二节花药和花粉培养的应用 花粉单倍体是纯合配子体 从来源于配子体的植株中选择某一种基因型的概率是 1 2 n 而从常规杂交F2代群体中 选择某一基因型的概率为 1 2 2n 故单倍体育种的选择效率为常规育种的2n倍 2 提高目标基因型的选择效率 例子 二倍体供体植株基因型为AaBb 若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株常规方法 AAbb出现的概率为1 16 并且不能将AAbb与Aabb aAbb区分开 ABaBAbabABAABBAaBBAABbAaBbaBaABBaaBBaABbaaBbAbAabBAabBAAbbAabbabaAbBaabBaAbbaabb 例子 二倍体供体植株基因型为AaBb 若要从后代中选择基因为AAbb的纯合单株单倍体方法 AAbb出现的概率为1 4 从来源于配子体的植株中选择某一种基因型的概率是 1 2 n 而从常规杂交F2代群体中 选择某一基因型的概率为 1 2 2n 故单倍体育种的选择效率为常规育种的2n倍 3 诱变育种中的作用 植株不受显隐性的影响 在诱变育种中能在当代及时获得突变个体 染色体加倍后成为稳定的纯系 可探索亲本染色体组的构成 分析单倍体植物减数分裂时 形成二价体的数目和形状 能确定染色体组内是否存在同源染色体 2 物种进化研究 单倍体植株中基因不受显隐性的影响 每一个基因的作用均能表现出来 能用来研究基因的性质及其作用 还可用于基因的剂量效应分析 3 遗传分析 4 构建连锁图谱 双单倍体 DH 群体是永久性群体 能有效地用于遗传图谱的构建 能直接表达外源基因 不受显隐性影响 5 用于遗传转化 第二节花粉孢子体发育途径 概念 花粉孢子体发育途径 雄核发育途径 花粉是产生花粉植株的原始细胞 其第一次有丝分裂 在本质上与合子的第一次孢子体分裂相似 把花粉形成植株的途径称为花粉孢子体发育途径 也叫雄核发育途径 一 花粉发育的阶段 花粉离体培养时 雄核发育最适宜的时期一般是第一次有分裂或之前 二 雄核发育途径 1 A途径小孢子第一次有丝分裂为非均等分裂 形成营养细胞和生殖细胞 1 A V途径由营养细胞重复分裂形成单倍体 2 A G途径由生殖细胞重复分裂形成单倍体 3 A VG途径 E途径 由营养细胞和生殖细胞各自独立分裂 共同形成单倍体 4 C途径营养细胞和生殖细胞通过核融合 形成多倍体植株2 B途径小孢子第一次有丝分裂为均等分裂 形成大小相近的两个细胞 然后由这两细胞连续分裂形成单倍体植株 或者核融合形成多倍体植株 1 雄核发育与P花粉的形成P 花粉 具胚胎发生潜能的花粉 也称小花粉 S 花粉 或不染色花粉 NS 花粉 2 雄核发育与饥饿处理饥饿处理改变了小孢子的配子体发育方向 启动雄核发育 三 雄核发育启动机理 1 胚状体发育途径小孢子经历胚发生的各个阶段 最后子叶展开 形成花粉植株 2 愈伤组织发育途径小孢子分裂数次形成愈伤 再分化形成花粉植株 此途径产生的植株会出现变异且倍性复杂 四 花粉植株形态发生方式 胚状体发育途径 部分花药通过胚状体途径形成小植株 烟草花药培养 通过胚状体途径再生形成小植株 烟草花药培养 胚状体发育途径 芸苔属小孢子培养 愈伤组织发育途径 部分花药产生愈伤组织 接种在平板上的水稻花药 水稻花药培养 水稻花药培养 第三节花粉和花药培养方法 一 花药培养二 花粉培养三 白化苗现象四 影响雄核发育和花粉花药培养的因素 一 花药培养 1 取材镜检 根据花粉的发育时期 选取大小适宜的花蕾 2 消毒70 酒精擦洗花蕾表面 或70 酒精浸泡30 60s后在1 次氯酸钠溶液中浸泡10 20min或在0 1 的氯化汞溶液中消毒3 10min 无菌水冲洗3 5次 3 培养固体或液体培养基均可 先进行脱分化培养 至小孢子大量分裂形成胚或愈伤 并突破花药壁表面 形成突出物 2 3周 后转入分化培养基培养 形成小植株 二 花粉培养 一 花粉的分离与纯化1 自然散落法 漂浮培养散落小孢子收集法 将花药接种在预处理液或液体培养基上 待花粉自动散落后 收集培养 2 挤压法在烧杯或研钵中挤压花药 将花粉挤出后收集培养 1 磁搅拌法用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药 使花粉游离出来 2 超速旋切法通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾 穗子 花药 使小孢子游离出来 此法应用最广 4 小孢子纯化对上述方法获得的小孢子混合物进行分级过筛 梯度离心处理纯化小孢子 3 机械游离 梯度离心前 小孢子形态 活力不一致 30 蔗糖梯度离心后 获得均一的小孢子群体 二 花粉培养方式 1 平板培养花粉置琼脂固化培养基上培养 2 液体培养花粉悬浮在液体培养基中培养 需震荡 以利通气 3 双层培养花粉置固体 液体双层培养基上培养 培养基制作方法 先铺一层琼脂固体培养基 凝固后 在表面加入少量液体培养基 4 看护培养利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育 用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞 并使其生长和增殖 这个愈伤组织块称为看护愈伤组织 1 在一个培养瓶中加入一定量厚的固体培养基 灭菌后备用 2 在无菌条件下 将一小块 1cm3 活跃生长的愈伤组织接种到培养基上 再在愈伤组织块上放一片 1cm 已灭菌的滤纸 放置过夜 3 将分离的花粉接种到已经充分吸收愈伤组织渗透液的滤纸上 4 单细胞分裂形成肉眼可见的小细胞团后 即转移到新鲜培养基上培养 恒温培养 得到单细胞无性系 2 看护培养图解 5 微室培养利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养 6 条件培养基培养利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上培养 花药条件培养基 子房条件培养等 微室培养图示 平视图 花粉培养过程 取花蕾 镜检 取花药 第一节花药和花粉培养技术 三 白化苗现象 一 白化苗产生的影响因素及机理1 内因供体植株基因型 如籼稻比粳稻白苗率高 花粉发育时期 2 外因预处理 培养基成分 激素水平与种类 培养条件和方法 愈伤组织转分化时间等 3 机理核基因起关键作用 导致质体DNA缺失 产生白苗 另外地 无性系变异也可能是原因之一 二 白化苗的控制 通过对花粉发育时期 预处理 培养基成分等因素进行调控 四 影响雄核发育和花粉花药培养的因素 一 基因型植物基因型是影响雄核发育的最重要的因素之一 同一物种中的不同基因型对小孢子离体诱导反应差异较大 如在水稻中 籼稻花粉培养力远低于糯稻 小孢子发育时期对诱导雄核发育非常重要 三 花粉发育时期 适宜时期 单核期 尤其是单核中 晚期 单核靠边期 芸苔属植物Brassicanapus不同基因型的小孢子产胚率比较 Topas10 000 200 0001 20Westar1000 10 0000 1 1Delta100 10 0000 01 1Bounty10 1000 001 0 01 基因型胚状体数量 106小孢子成苗率 1 植株生长条件光温等因素均能影响花药培养力 一般处于适宜生长条件 如温室中 较好 但物种间存在差异 2 植株生长时期一般是开花始期优于开花末期 3 P花粉的频率不同温度 日照时数 氮饥饿及生长物质处理提高P花粉的数量 二 供体植株生长条件和生理状态 随着细胞体积迅速增大 细胞核由中央位置推向一边 即单核靠边期 四分体 醋酸洋红染色 四分体 Alexander s染色 单核期 双核期 成熟花粉粒 处于不同发育时期的烟草小孢子 一般而言 单核期 第一次有丝分裂前 对诱导反应最敏感 为最佳培养期 形成双核后 在合适的条件 主要由营养细胞分裂产生胚状体 不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期 对不同发育阶段的花药进行培养测试确定最佳小孢子发育时期的形态特征注意形态特征会因品种 发育状态 环境条件的变化而发生变化 处于不同发育阶段的烟草花芽 花粉发育时期的确定 单核期的确定 根据细胞观察推测 双核期的花粉中开始积累淀粉 不能使花粉发育成植株 通常采用醋酸洋红或碘化钾染色 再压片镜检 以确定花粉的发育时期 但是接种前不可能把所有的花粉都进行一次发育时期的镜检 通常是按照花蕾长度大小与花粉发育年龄的相关性 实际操作中取一定大小的花蕾进行的 A 通过显微镜下观察确定小孢子发育时期 醋酸洋红染色 DAPI染色 B 通过花蕾外部特征确定小孢子发育时期 花蕾的外部形态特征与小孢子的发育时期有一定的相关性 花蕾萼裂基部与花冠顶部之差可以作为判断小孢子发育时期的基本指标 预处理是小孢子培养成功的前提条件预处理目的 是改变小孢子的发育方向 使尽可能多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径 即成为具胚胎发生潜力的小孢子 适当的预处理能使绿苗产量大量增加 预处理方法 主要是对花药进行适度的逆境处理 包括低温 高温 化学物质 离心 射线等 四 预处理 1 高低温处理低温冷藏是最常用的方法从健壮无病植株采集花蕾 将花蕾用湿纱布包裹放入塑料袋中 置冰箱冷藏 低温处理可阻止小孢子正常分化 使停留于单核状态的花粉显著增多 有利于诱导分化愈伤组织和胚状体 例子 十字花科未经低温预处理的花蕾 每花药产胚数为4 39个 6 9 处理1天 产胚数提高到61 4个 预处理4天后 胚状体产量降为10 47个 预处理方法 高温处理 热击处理 指花药接种后 先在较高温度下 30 35 培养数天 然后再移至正常温度下继续培养 例子 如烟草 32 高温 小麦 33 高温预处理显著地提高了小孢子胚胎发生能力 Touraev 1996 2 化学物质处理 包括高糖 甘露醇 秋水仙素 乙烯利等进行处理 甘露醇仅能维持渗透压 不能提供碳源 其主要原理是造成小孢子营养饥饿 从而使小孢子去分化 3 其它 包括 射线 离心 磁场等 五 培养基 1 基本培养基主要为N6和MS培养基 MS和H培养基 适合双子叶植物花药培养 B5培养基 适合豆科和十字花科花药培养 N6培养基 适合禾谷类作物的花药培养 Nitsch培养基 适合芸薹属和曼陀罗属 高浓度的NH4 显著抑制花粉愈伤组织形成 铁盐对花粉胚状体发育很重要 活性炭促进胚状体发育 包括蔗糖 麦芽糖 纤维二糖 葡萄糖 果糖 海藻糖等 不同作物所需最适的碳源种类及浓度的所差异 在辣椒花药培养中以6 的蔗糖浓度对胚状体的诱导率为最高 在番茄花药培养中需要量高达14 其原因是花粉母细胞的渗透压比花丝等体细胞高的缘故 即高浓度的蔗糖不利于药壁 花丝等体细胞的生长 而利于花粉的生长 一般认为单子叶植物比双子叶植物需糖的浓度要高 玉米中蔗糖效果最好 而麦类作物中 麦芽糖似乎为最好的碳源 较高浓度蔗糖可诱导花粉形成愈伤组织 较低浓度蔗糖可使愈伤组织分化成苗 2 碳源 3 激素细胞分裂素可促进胚状体形成 生长素可诱导愈伤组织形成 细胞分裂素与生长素比值高时可诱导愈伤组织分化苗4 氨基酸5 活性碳6 pH 六 培养条件 1 温度物种间有差异 培养温度在25 28 左右2 光照光暗交替培养 每天12 18h的光照 光照强度2000 10000lx 3 植板密度植板密度与花培效率有很大的相关性 5 103到2 104 ml密度均能有效培养 一般来说 足够数量的 但相对低密度的小孢子浓度有利于小孢子竞争营养 氧气 细胞分裂的空间 从则有利于胚状体发生 花药组织的存在对小孢子的胚性分裂具有明显的促进作用 但花药壁损伤会释放有毒物质影响小雄核的发育 七 花药壁因素 第四节单倍体植株鉴定和染色体加倍 一 倍性鉴定 二 染色体加倍 一 倍性鉴定 为什么要进行倍性鉴定 1 染色体直接计数法通常取根尖 茎尖等分生组织区进行制片 直接计数染色体数目 2 间接鉴定 1 扫描细胞光度仪鉴定 流式细胞仪 主要测定叶片单个细胞中DNA的含量确定细胞的倍性 材料的使用量可少到1cm2 2 细胞形态学鉴定法叶片保卫细胞大小 单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性 3 植株形态学鉴定法单倍体植株瘦弱 叶片窄小 花小柱头长 花粉粒小 不结实 4 杂交鉴定法自交或测交鉴定 看后代分离情况确定二倍体植株是来自小孢子还是体细胞 5 分子标记鉴定包括生化标记 如同工酶标记 和分子标记 如RFLP RAPD AFLP等 二 染色体加倍 为什么要进行加倍 1 自然加倍 花粉细胞核有丝分裂或核融合可自然加倍 其优点是不会出现畸形 缺点是随机性强 难以掌握和利用 2 人工加倍 用秋水仙素溶液浸苗 处理愈伤组织和用含0 4 秋水仙素的羊毛脂涂抹单倍体植株的顶芽 腋芽 可得到能结实的二倍体植株 3 愈伤组织反复继代培养 可得到二倍体植株 将单倍体植株 孢子体 的茎段 叶柄 根茎切下 置适宜的培养基上使之发生愈伤组织 反复继代后再将愈伤组织转移到分化培养基上 即可获得较多二倍体植株 由于单倍体愈伤组织在培养过程中会有一定高频率的核内有丝分裂 从而形成二倍体细胞 分化出纯合的二倍体植株 第一节花药和花粉培养技术 单倍体植物天然发生的途径 孤雌生殖 孤雄生殖 无配子生殖 也称单性生殖 即卵不经过受精也能发育成正常的新个体 配子体可以不经过配子的结合 而直接产生孢子体的 这种现象叫做无配子生殖 花药和花粉培养基本流程 花药培养脱毒 1974年日本 花药培养可以脱除草莓病毒 花药采取时期单核期 花蕾4 6mm 花药1mm花药诱导愈伤组织培养基MS IAA4mg L BA2m