标记HRP——简易过碘酸钠法.doc

精品文档标记HRP简易过碘酸钠法1.原理：经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP上残留的-和氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低PH下使NaIO氧化HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭HRP步骤。HRP经NaIO氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH(或乙醇胺)还原生成稳定的酶标记抗体试剂及器材(1)0.1MNaIO：称取241mg高碘酸钠溶于10ml蒸馏水中。(2)1mMPH4.4醋酸钠缓冲液:0.2MNaAc(1.361克50ml)3.7ml0.2MHAc(0.601ml50ml)6.3ml加蒸馏水至2,000ml。(3)0.2MPH9.5碳酸盐缓冲液:NaCO0.32克NaHCO0.586克加蒸馏水至50ml再用蒸馏水作20倍稀释，即成0.01MPH9.5的碳酸盐缓冲液。(4)NaBH溶液(4mgml):临用时称取NaBH4mg溶于1ml蒸馏水中。(5)0.15MPH7.4PBS（6）饱和硫酸铵操作步骤(1)称取5mgHRP溶解于1ml蒸馏水中。(2)于上液中加入0.2ml新配的0.1MNaIO溶液，室温下避光搅拌20分钟。(3)将上述溶液装入透析袋中，对1mMPH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4过夜。(4)加20l0.2MPH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.09.5，然后立即加入10mgIgG(抗体，或SPA5mg)在1ml0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时。(5)加0.1ml新配的4mgmlNaBH液，混匀，再置42小时。(6)将上述液装入透析袋中，对0.15MPH7.4PBS透析，4过夜。(7)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置41小时。(8)3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15MPH7.4的PBS中。(9)将上述溶液装入透析袋中，对0.15MPH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。结果判定定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程1cm)。酶量(mgml)OD403nm0.4IgG量(mgml)(OD280nm-OD403nm0.3)0.62酶量(mgml)IgG量(mgml)酶量克分子比值440,000160,000IgG量操作步骤（1）称取5mgHRP溶解于0.5ml蒸馏水中。（2）向溶液中加入0.5ml新配的0.1MNaIO溶液，混匀，4静置30分钟。（3）加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml，混匀，静置30分钟。（4）加入含5mg抗体的水溶液1ml，混匀装入透析袋，pH9.5碳酸盐缓冲液透析，4过夜。（5）加0.2mL新配的5mg/mLNaBH液，混匀，再置4,2h。（6）在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置41h。（7）3000r/min离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于少量0.15moL/LpH7.4的PBS中。（8）将上述溶液装入透析袋中，对0.15moL/LpH7.4的PB缓冲盐水透析，去除铵离子后(用萘氏试剂检测)，10,000r/min离心30min去除沉淀，上清液即为酶结合物，分装后，冰冻保存。注意事项（1）为提高标记效率，应严格掌握整个反应体系中的抗体含量。（2）碘酸钠要新鲜配制。操作步骤(1)取HRP5mg溶于0.2mol/L，pH5.6醋酸盐缓冲液1ml中，加入1%DNFB无水乙醇溶液0.1ml，室温下轻微搅拌1h；(2)加入新鲜配置的0.1mol/LNaIO40.5ml，此时溶液由原棕色变为墨绿色，置4放置30min，此时溶液由原棕色变为墨绿色；(3)加入2.5%乙二醇1ml，室温下轻微搅拌1h，终止反应；(4)加入待标记的抗体5-10mg，用1.0mol/L，pH9.5CBS，调节pH值至9.0；(5)混匀，置4过夜(6)加入硼氢化钠溶液0.1ml，混匀，4放置3h；(7)对0.01mol/L，pH7.4PBS，4透析过夜，换液3次；(8)3000r/min离心30min，去除沉淀物；(9)收集上清液即为酶标记抗体。【注意事项】(1)在氧化HRP时，以pH5.6醋酸盐缓冲液溶解酶为宜。(2)一般认为氧化HRP5mg，NaIO4量以0.06mol/L0.5ml为宜，不能低于0.015mol/L0.5ml。(3)氧化HRP时间以15-30min为宜。(4)加入DNFB的目的是为了封闭酶蛋白中残留的a-和e-氨基。(5)加入乙二醇的目的是终止反应；为便于在加入抗体后调pH值，故乙二醇要用0.05mol/LCBS配制。改良过碘酸钠法：取5mgHRP溶于0.5ml双馏水中，加入新配制的0.06Mol/LNaIO4水溶液(10ml双馏水128mgNaIO4)0.5ml，混匀，置430min；取出后加入0.16Mol/L乙二醇水溶液(10mlH2O+0.09ml乙二醇)0.5ml，室温放置30min；加入含5mg纯化抗体的水溶液1ml，混匀，并装入透析袋，对0.05Mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液缓缓搅拌透析6h(或过夜)，使之结合；加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml，混匀，置42h；在以上溶液中缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，430min，离心，去上清，沉淀以少许0.02Mol/LpH7.4PBS液溶解，装入透析袋，以同样液体在4透析除盐过夜；次日取出离心，以除去不溶物，即得酶抗体(HRPIgG)结合物，以0.02Mol/LpH7.4PBS液加至5ml；效价测定合格后，加入等量优质甘油，分装小瓶，低温保存。PB和PBS是免疫细胞化学实验中最为常用的缓冲液，0.01mol/L