发酵调控学1

发酵技术与调控,郭美锦生物工程学院,课程内容,1 微生物生长分化调节的规律(1)细胞周期内有关生长的活动，DNA合成与细胞分裂的调节(2)丝状菌生长分化的调节2 初级代谢的调节机制(1)调节的生化基础(2)代谢调节的方式与内容：诱导、分解代谢物调节、反馈调节,课程内容,3 次级代谢物的生物合成的调节(1)次级代谢物的概念(2)生物合成的前体(3)次级代谢物的生物合成(4)抗生素生物合成的控制,课程内容,4 发酵过程控制(1)控制的策略(2)参数的指导作用(3)参数相关分析(4)过程控制的评价,主要参考书,现代工业发酵调控学，储炬，李友荣，化学工业出版社，北京。2002年1月Biotechnology, 2nd ed. Vol.1; Biological Fundamentals. Rehm H-JBBiotechnology, 3nd ed Vol.3;Bioprocessing. Rehm H-JB,绪论,一、发酵调控 学开设的必要性、目的意义全称：发酵过程微生物的内在调节与外部控制发酵工艺向来被认为是门艺术而不是科学，完全凭经验操纵。尽管生物系统发酵过程极其复杂，但由于有许多相关学科(生物化学、分子遗传学、计算科学)的迅速发展，有可能把一些表面现象和菌的内在本质联系起来。,发酵(Fermentation ),定义：细菌和酵母等微生物在无氧条件下，酶促降解糖分子产生能量(ATP)的过程。(底物水平磷酸化),发酵(Fermentation ),通过微生物（或动植物细胞）的生长培养和化学变化，大量产生和积累专门的代谢产物的反应过程 (电子水平氧化),NADH,微生物生理学严格定义的“发酵”,有机物被生物体氧化降解成氧化产物并释放能量的过程统称为生物氧化。 微生物生理学把生物氧化区分为和发酵.呼吸(Rispiration): 有机体利用氧气通过代谢分解有机化合物释放化学能的过程 呼吸又可进一步区分为有氧呼吸和无氧呼吸。因此，发酵是生物氧化的一种方式。,工业生产上定义的发酵“工业发酵”,工业生产上笼统地把一切依靠微生物的生命活动而实现的工业 生产均称为“发酵”。这样定义的发酵就是“工业发酵”。工业发酵要依靠微生物的生命活动，生命活动依靠生物氧化提供的代谢能来支撑，因此工业发酵应该覆盖微生物生理学中生物氧化的所有方式： 有氧呼吸: C6H12O6+6O2CO2+12H2O+ATP 无氧呼吸:C6H12O62C2H5OH+2CO2+ATP,发酵的类型,按发酵原料来区分：糖类物质发酵、石油发酵及废水发酵等类型。 按发酵产物来区分：如氨基酸发酵、有机酸发酵、抗生素发酵、酒精发酵、维生素发酵等。 按发酵形式来区分，则有：固态发酵和深层液体发酵。 按发酵工艺流程区分则有：分批发酵、连续发酵和流加发酵。 按发酵过程中对氧的不同需求来分，一般可分为：厌氧发酵和通风发酵两大类型。,发酵工程在生物工程中的位置,基因工程细胞工程酶工程蛋白质工程发酵工程,微生物发酵代谢调控与发酵过程优化技术,代谢调控学是生物工程中的重要研究方向，是进行过程优化的基础。其内涵及研究深度也随着生物技术的飞速发展而扩增，会派生出新的分支，如代谢工程等。只有深入研究微生物的内部调节规律和体内各种反应的启动、中止、前后连接、耦合的次序及方式，充分了解微生物的代谢调节规律，掌握微生物生理和代谢的协调，才能打破其固有的遗传守恒，充分表达其潜在的遗传型。,微生物发酵代谢调控与发酵过程优化技术,世界上借助细胞培养的产品已占生物技术的40以上，达数百亿元的产值。要提高生产水平，无不涉及到细胞代谢与及其调控的研究。由此生产的抗生素、氨基酸、维生素等在整个医药产品中占很大比例。,微生物发酵代谢调控与发酵过程优化技术,膜过滤发酵与分泌机制的研究都是围绕如何除去对产物合成有害的代谢物，与避开终产物的反馈调节作用。膜过滤与发酵耦合成功地应用于解除对产物合成的不利作用，导致葡萄糖氧化酶的总产量提高2倍；利用超声波等因素促进产物的分泌，使庆大霉素发酵单位提高1.7倍。,微生物发酵代谢调控与发酵过程优化技术,目前大量生物技术已从实验室成果走向产业化，特别时基因工程药物、疫苗、单克隆抗体等进入商品化阶段，成为国民经济重要的支柱产业。由于生物过程特点表现在检测参数的多样性，相关耦合性，时变性，如果进一步与实验室手工参数结合，就可对过程工艺进行深入分析。,过程优化为目标的相关参数分析与控制,发酵是各种生化反应的综合过程，只要某一因素成为限制条件，就会对生产产生严重影响。如何认识和发现这些限制因素就成为重要的研究课题。必须从物料或能量流的变化才能发现其中的本质。发酵过程调控与计算机在线传感控制相结合，达到过程优化。,微生物发酵代谢调控与发酵过程优化技术,我们在红霉素发酵生产过程优化研究中，把生物反应器的物料流与细胞内的代谢流结合起来，进而把发酵过程的生理调控研究与发酵过程优化控制联系起来，发现了许多长期以来有经验总结但又无法进一步解释的现象，在15L规模达到了发酵水平提高60以上的幅度。,微生物发酵代谢调控与发酵过程优化技术,在向生产规模放大时，提出了放大后的差异以参数相关理论从工艺上调整给补的方法，实现了从15L直接成功地放大到50M3规模。,微生物发酵代谢调控与发酵过程优化技术,在毕赤酵母表达重组人血清白蛋白时，研究了以甘油为基质的菌体生长阶段和以甲醇诱导产物表达阶段的物料流变化特性，进而解决了由于高密度培养所引起的供氧问题，在50L发酵罐规模从数百mg/L的水平提高了数十倍，并进一步放大到500L规模，避免了通纯氧问题。最近在肌苷、鸟苷发酵研究方面又取得的突破，也是在这些理论指导下取得的。,微生物发酵代谢调控与发酵过程优化技术,代谢调控是研究内在的调节机制，而过程优化则是外在控制，是建立在相关参数的分析上的，这两个方向相辅相成，前者为后者的基础，而后者是使理论变为现实的手段。,The general layout of a biotechnical production process,二十一世纪的生命科学,Renewable raw materials,BiofuelsBiomaterialsChemicals,Cell Factory,Industrial biotechnology: Gateway to a more sustainable future,Figure1.Idealized biorefinery concept.(Image courtesy of Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN, USA.),1 微生物生长与调节,为了控制菌体的生长，需要了解生长的方式，细胞分裂和调节的规律，测量微生物生长的各种办法，微生物生长繁殖的形式与工业生产的关系，环境变化对微生物生长的影响。因此，研究微生物的生长分化规律无疑是发酵调控原理的一个重要组成部分。,常用工业微生物郭美锦,一、细菌 （Bacteria）,概念：细菌是一类细胞细而短，结构简单， 细胞壁坚韧，以二等分裂方式繁殖，水生性较强的原核微生物。分为：1球菌Coccus2杆菌Bacillus3螺旋菌Spirilla,细胞个体呈球形或椭圆形，不同种的球菌在细胞分 裂时会形成不同的空间排列方式，常被作为分类依据。0.51.0m 有单球菌、双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌、葡萄球菌等。如金黄色葡萄球菌、淋病奈瑟氏球菌、肺炎链球菌等。,1球菌Coccus,2杆菌（Bacillus ）,宽0.41.0m 长0.74.0m 常见有短杆状、棒状、梭状、梭杆状、月亮状、分枝状、竹节状等。细胞呈杆状或圆柱形，一般其粗细（直径）比较稳定，而长度则常因培养时间、培养条件不同而有较大变化。,芽孢杆菌B. subtilis,大肠杆菌 E.coli,Eg. 枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、铜绿假单胞菌（绿脓杆 菌）、结核分枝杆菌、炭疽病的病原菌（炭疽杆菌）、 破伤风梭菌等。,细菌菌落形态（Clone Morphology),大肠杆菌菌落（E. coli Colonies grown on LB plates）,3螺旋菌Spirilla,有弧菌、螺旋菌、螺旋体菌等。弧菌Vibrio：菌体只有一个弯曲，其程度不足一圈，形似“C”字或逗号，鞭毛偏端生。如寄生性弧菌（蛭弧菌）、霍乱弧菌等。,二、细菌细胞结构,放线菌 Actinomyces,放线菌是一类呈丝状生长，主要以孢子繁殖和陆生较强的原核生物。在形态上具有分枝状菌丝、菌落形态与霉菌相似，以孢子进行繁殖。“介于细菌与丝状真菌之间又接近细菌的一类丝状原核生物”；是抗生素的主要产生菌：Walksman 链霉素。抗生素（其中90%由链霉菌产生）。,放线菌的形态构造 包括基内菌丝，气生菌丝，孢子丝及孢子各部分组成。,S.rimosus colonies,Mycelium of Streptomyces in submerged culture,酵母状真菌 -酵母（Yeast）,酵母菌（yeast）是一群单细胞的真核微生物。这个术语也是无分类学意义的普通名称，通常用于以芽殖或裂殖来进行无性繁殖单细胞真菌，以与霉菌区分开。,啤酒酵母（Saccharomyces cerevisae）,个体形态,卵圆、圆、圆柱、梨形等单细胞，其细胞直径一般比细菌粗10倍左右。有的酵母菌子代细胞连在一起成为链状，称为假丝酵母,Pichia pastoris,丝状真菌霉菌（Mold）,霉菌（mold）即发霉的真菌，通常指那些菌丝体比较发达而又不产生大型子实体的真菌。 应用：风味食品、酒精、抗生素（青霉素、灰黄霉素）、有机酸（柠檬酸、葡萄糖酸、延胡索酸等）、酶制剂（淀粉酶、果胶酶、纤维素酶等）、维生素、甾体激素等；饲料发酵、植物生长刺激素（赤霉素）、杀虫农药（白僵菌剂）,：,霉菌的形态结构,霉菌菌体均由分枝或不分枝的菌丝(hyphae)构成。许多菌丝交织在一起，称为菌丝体(mycelium)。菌丝在光学显微镜下呈管状，直径约2-10微米，比一般细菌和放线菌菌丝大几倍到几十倍，与酵母菌的相似。,根霉属(Rhizopus)俗称面包霉 孢子丝和孢子,无性孢子,曲霉,青霉孢子,金针菇,香菇,红曲霉菌丝培养图,Thanks for your listening!,细胞周期,对于个体细胞行为，主要关心染色体启动、复制和分离新细胞壁材料的合成与插入协调染色体复制和细胞分裂的信号,细胞周期,细胞周期(Cell cycle)： 细胞的一系列可鉴别的周而复始的生长活动。这些活动的顺序不变, 完成一个活动后才能进行下一个活动。,图1 细胞周期,细胞周期,典型的真核生物细胞周期如图所示: S, M和G1, G2分别代表DNA 合成, 有丝分裂期和两次间隙。若生长速率因养分多寡而改变, S, G2 和M 几乎不变, 只有G1改变。MTG: mean generation time,细胞周期,原核生物在低生长速率下的细胞周期, 与真核生物相似。其染色体复制期C 相当于 S；细胞分裂期 D相当于G2+M；C 和D 不随生长速率变化, 只有G1可变动。细胞周期的各项活动怎样去适应生长速率变化的需要？,染色体复制与细胞分裂的调节,染色体复制怎样与细胞分裂协调？ 在高速生长下, 如细胞周期为30 min, 染色体复制不能在一个周期内完成。为此，未等前一轮复制结束，后一轮复制又在原点上启动。可以把C 期的启动和终止,以及细胞分裂看作是不可更改的活动顺序, 称为C+D 周期。,染色体复制与细胞分裂的调节,若增代时间少于 C+D时间, C+D 周期重叠，其重要特征是分配到子细胞的染色体已开始新的一轮复制。这类染色体称为二叉染色体(dichotomous)。,图2大肠杆菌的染色体复制和细胞分裂的时间分配示意图,染色体复制和细胞分裂的调节规律,染色体复制未完成， 细胞就不会分裂。不管生长速率如何，大肠杆菌的细胞分裂总是出现在染色体复制完成之后。不管生长速率如何，C 和D 所需时间大致不变。C 和 D可以依次或同时(指上一轮的 D和下一轮的C ) 进行。,思考题,加倍时间最小为多少？C40， D20时，时间如何分配？,染色体复制的启动,染色体复制的启动受启动因子(origin), 一种特异调节性蛋白的正向控制。当启动因子增加到某一临界水平, 启动便开始。在这以后启动因子被毁或稀释。合成启动因子达到有效浓度所需的时间恰好等于培养物增代时间。,染色体复制的启动,大肠杆菌在启动时的启动因子数量与细胞质量之比在各种生长速率下是一样的。这一比例实际上是染色体启动因子的浓度。细胞似乎能检出启动因子的浓度。当它达到一临界值时便启动新一轮的复制。启动的直接后果是启动因子的浓度提高一倍。,染色体复制的启动,启动不会重新发生直到其浓度因生长而降到临界值。这种控制机制构成一种生物钟。它是以细胞体积或其它有关参数为依据。据此，染色体复制的启动频率是DNA 合成速率的控制步骤。,染色体复制的启动,O/M=I 启动， 启动后，2O/M=I,II 不再启动， M增加，M 2M，使I逐渐下降， 2O/2M=O/M=I，又开始启动。,启动和复制是性质截然不同的两种过程,启动的过程需要蛋白质合成，如蛋白质合成受阻，已启动的DNA合成能完成，但不能启动新一轮DNA合成 。曾检出其产物负责启动而不负责随后复制的基因；加入利福平或氯霉素抑制RNA或蛋白质合成或除去营养缺陷型所需的氨基酸都能阻止启动，但允许复制继续完成；培养物进入稳定生长期后，中止生长的细胞含有完整的染色体。,染色体复制的启动,启动总是在染色体上的专一位置上进行。此位点称为复制或染色体原点。在大肠杆菌此位点很靠近ilv座位。在大肠杆菌和枯草杆菌中复制叉以两个方向沿染色体运行，大约在离原点180度地方相遇。,染色体复制的启动,启动的频率取决于细胞量增长的速率，即生长停止，启动也随着停止是预料中的事。,细胞周期的研究方法,1 镜检法 用电子显微镜观察单个细胞的生长，定时拍照。由此发现大肠杆菌在分裂时细胞个子的变化不大。,细胞周期的研究方法,1 镜检法 说明似乎存在一种控制细胞个子大小的因子，即尺寸因子(size factor), 可能是启动细胞质量(initiation mass)。,1 镜检法,缺点:细胞由培养液转移到固体表面,会受到干扰。 细胞年龄变化较大时,细胞大小变化不大。,2 同步培养(Synchrony)法,(1) 密度梯度离心沉降法 按细胞的大小/年龄把在对数生长期的培养物分级。 H2O/D2O密度梯度沉降法: 能应用于任何品种, 不会施加渗透压强 的影响。 从某一密度带便可分离出同质的细胞群体，随后培养。,细胞大小的分布频率与蛋白质合成速率的关系,细胞大小的分布频率与蛋白质合成速率的关系,蛋白质合成速率与细胞长度(体积)成正比，从而与细胞年龄成正比。,(2)过滤洗脱法,将细胞粘附在固体支持物，如硝化纤维膜上，然后将其倒置，让生长培养基从上到下通过，新生的细胞便被洗脱到培养基中，呈一种特征性的振荡模式，见图123。,过滤洗脱法,(2)过滤洗脱法,在初始冲洗(wash-off)期后从滤膜上洗脱下来的主要是新分裂的细胞。在洗脱曲线高峰下从膜上洗下的细胞是沉积在膜上的新生细胞后代，那些在低峰下的是其沉积时正要分裂细胞后代。,过滤洗脱法,洗脱(wash- off)的振荡模式可以测出细胞周期。,3 同位素示踪法,如亲本培养物沉积在滤膜上之前用氚标记的胸苷使细胞带上标记，则结合到洗脱细胞的标记量与结合到亲本培养物那一年龄细胞的标记量成正比。,细胞周期,细胞周期,其一个洗脱峰(后代)带有比前一代少一倍的放射性标记。 可以分别求得C和D值,3 同位素示踪法,另一种研究细胞周期的方法是通过蔗糖密度梯度离心，使一对数生长的培养物沉淀, 收集最上层的细胞，在含有氚-标记胸苷的生长培养基上生长，测量其DNA合成速率。,3 同位素示踪法,洗脱前在无标记培养基中生长，洗脱时用带标记的培养基，得到的带标记DNA呈阶梯上升状。,细胞周期,4 生长速率与细胞个子大小的关系,生长培养基越丰富，细菌生长速率加快，其细胞的个子也越大。 如在同一种培养基内改变温度也会影响生长速率，但对细胞个子大小几乎没有多大影响。,4 生长速率与细胞个子大小的关系,如一细胞的增代时间为60min，在细胞分裂时染色体复制便开始启动。假设细胞这时具有质量为M (启动细胞量=1/启动因子浓度)。,4 生长速率与细胞个子大小的关系,个体细胞的量在指数地增加，直到2M，细胞便开始分裂。 此时从培养液中检出新生的细胞，置于较丰富的培养基 (能使菌快速生长, 增代时间为35 min) 中，并假定细胞迅速调整到新的生长速率。,4 生长速率与细胞个子大小的关系,这样，个体细胞量增长速率往上移动，如C+D规律还适用，下一个细胞分裂的时间不会变动，但细胞个子会增大。 新一轮复制的启动将在细胞分裂前便开始。,4 生长速率与细胞个子大小的关系,换句话说，C+D 周期现在开始重叠。快速生长经一个细胞周期后便达到新的平衡。生长速率越快，细胞个子的差异也越大。,生长速率对细胞个子和染色体复制启动时间的影响,生长速率对细胞个子和染色体复制启动时间的影响,可用式1-27 表示细胞周期t对指数培养物的细胞个子平均大小M 的影响。 M = K2(C+D/t) (1-27) 曲线的形状将取决于C，D 和K 是否变，只有在简单情况下logM与t作曲线才会得一直线。,细菌培养物的生长周期,在一来自静止期细胞的培养物的生长期间，在细胞数目开始增加以前有一相当长的停滞期。细胞量开始增长的滞后现象短一些。,细菌培养物的生长周期,如达到物态的指数生长，则所有可测的参数也将平行地增长。当培养物进入静止期便发生与上述相反的活动顺序。因启动速率比细胞分裂早减速CD分钟。细胞量增长下降时，细胞分裂继续指数进行，细胞渐渐变小。,细菌培养物的生长周期,细菌培养物的生长周期,新的一轮DNA复制的启动频率取决于新细胞量的积累速率，则吸光度与细胞数目至少有CD分钟不平行。,生长速率和DNA浓度,细胞中的DNA%随生长速率的增加而下降，可用式1-28表示:G/M=/(KC ln2)(1-2-C/) (1-28)式中G 是基因组的当量，为每个细胞的DNA 平均值。,生长速率对DNA浓度和平均染色体构型的影响,展示了3种质量倍增时间：a) 70 min，b) 40 min，c) 20 min,生长速率对DNA浓度和平均染色体构型的影响,一个启动细胞量单位含有一个刚开始一轮复制的染色体。用一水平线C 分钟长度表示。它在纵轴上所处高度代表细胞量。假定细胞量的复制时间为70 min，见图1-28a，将出现轮与轮复制的间隙。当细胞量增加到三倍时它将完成4 个复制好的染色体。,生长速率对DNA浓度和平均染色体构型的影响,如在零小时把细胞置于增代时间为40 min的培养基内，见图1-28b，则新一轮复制将紧跟在上一轮复制完成之后开始，轮与轮之间不存在间隙。待细胞量增到3个单位时，第二轮的复制将不会完成。结果得到2条复制了一半的染色体，DNA浓度下降到3/3。,生长速率对DNA浓度和平均染色体构型的影响,如将细胞置于增代时间为20 min的培养基内, 在第一轮复制还未完成前第二轮复制已开始。当细胞量达到3 时, 只有一个带三个复制叉的染色体，见图1-28c，DNA 浓度进一步下降到2.25/3。,生长速率对DNA浓度和平均染色体构型的影响,生长速率影响染色体上不同位置的相对基因拷贝数,在一随机的指数培养物中，接近原点处的基因，其拷贝数总是居多，靠近两端的较少。 这种相对基因剂量的倾斜度随生长速率的增加而提高。,生长速率影响染色体上不同位置的相对基因拷贝数,DNA的浓度随生长速率的增加而下跌，从而不同程度地影响基因浓度。那些靠近染色体原点的基因浓度没有变化；位于中间的基因平均浓度则只有原点周围的一半左右；处在染色体复制近末端的基因浓度最低。,生长速率影响染色体上不同位置的相对基因拷贝数,在一个细胞周期内，一个基因浓度相对另一个而言，可相差4倍。生长速率对不同作用，提供了一种解释非随机基因次序的理由。,生长速率影响染色体上不同位置的相对基因拷贝数,据此，对生长速率有限制作用的应位于靠近染色体原点处。其实，这是为什么大肠杆菌中有6 个拷贝编码核糖体RNA的基因都聚集在原点的附近的缘故。,生长速率对细胞组分的影响,每个细胞RNA随生长速率的变化可以达10倍之多。在快速生长的细胞中RNA的含量可以达到细胞重量的30。每个细胞的DNA也随生长速率的提高而增加，但程度低一些。因此，以细胞重量衡量，DNA含量是减少的。细胞的外壳的厚度通常不变，胞壁和质膜在整个细胞中的比例随细胞个子的增大而减小。,丝状菌生长分化的调节,微生物的生长调节 微生物的生长分化受其自身和外界多种因素的调节。这里以真菌为对象，阐述菌丝体形态调节的规律。,丝状菌生长分化的调节,霉菌和放线菌均为丝状微生物。其生长方式是菌丝 (hyphae) 末梢伸长、分枝 (图1-5) 和交错成网 (图1-6)，称为菌丝体 (mycelium)。一定长度的真菌菌丝，其横切面有间隔膜。真菌属真核生物，为多细胞，且每个细胞含有多个细胞核和各种细胞器。,丝状菌生长分化的调节,细胞一旦形成后便保持其完整性，且与其相邻细胞的菌龄不同，越靠近末梢的菌丝，越年轻。 放线菌、链霉菌和诺卡氏菌属均属于放线菌属，为原核生物，革兰氏染色呈阳性。它们无核膜和细胞器，其菌丝直径 (约1 m) 比霉菌 (2-10m) 细，易折断。许多真菌能形成孢子，称为分生孢子。,产黄青霉分散的菌丝体,放线菌菌丝体,放线菌菌丝体,Forms of morphology found in typical submerged cultures of filamentous fungi and actinomycetes,菌丝顶端生长(Apical growth of haphae),菌丝仅在顶端(末梢)生长, 其余部分的菌丝壁加厚，但不扩展。 居间生长(intercalary growth)的细胞的任何部分均能扩展与分裂。,菌丝顶端生长机制,大多数菌丝顶端生长机制都与泡囊(vesicles)在顶端的聚集有关。一旦生长停止，泡囊在顶端消失，并分布在次顶部生长区。,菌丝顶端生长机制,一种推测的细胞壁单位的生长活动,a) 含有细胞壁溶解酶的泡囊与质膜融合；b) 细胞壁的网状结构局部拆开，从而取得塑性；c) 细胞壁由于原生质内部压力而扩展，泡囊与质膜融合，释放出细胞壁合成酶；d)新细胞壁的合成前体由泡囊提供，细胞壁的合成从质膜向外扩展；e) 新细胞壁单元被合成。,泡囊是什么?,泡囊是一种由单层膜包裹的细胞器, 可把它看作是溶酶体复合物或内膜复合物的一部分。 还含有细胞壁合成酶以及细胞壁的若干前体。它在胞内起运输材料的作用。,泡囊如何在菌丝顶端聚集,内质网系统产生泡囊的区域位于菌丝的次顶部, 藉化学或电化学浓度梯度(推动力)移动的。菌丝顶端全靠发酵维持。因无线粒体，顶部以外的细胞靠线粒体进行正常呼吸。,泡囊如何在菌丝顶端聚集,用细胞松弛素(Cytochalasin)可以完全抑制细胞质的流动，从而阻止泡囊的移动和生长。故细胞质的流动是生长的推动力，使泡囊流向菌丝顶端。,泡囊如何在菌丝顶端聚集,如菌丝顶端同其次顶部区域被隔离, 则生长便缓慢下来； 如切断的地方离开顶端远些, 对生长的影响便小得多。 据此，可测定末稍生长区域的长度。粗糙链孢霉顶端生长的低限长度为10 mm。,两种形式的胞质流动,一种是导向菌丝顶端的快速流动。菌丝顶端失水, 造成顶端与次顶端之间的水势梯度，从而加速这种流动。 另一种形式的胞质流动为双向流动或环流 (Cyclosis) , 其流动速率要慢得多。,泡囊的形成,泡囊的形成是由高尔基(Golgi)体或内质网(Endoplasmic reticulum) 的特定区域释放，再输送到生长点，与质膜结合。,泡囊的三种作用,1) 运输各种负责把细胞壁拆开和扩建的酶； 2) 运输新的细胞壁成分, 其前体或预制单位； 3) 运输合成。,菌丝生长过程,对孢子发芽的研究可获得有关顶端生长的有用的信息。 如图所示, 开始孢子吸水膨胀, 这时细胞壁合成材料散布在孢子周围内表面, 随后长出芽管，新材料便聚结在芽管的顶端。,菌丝生长过程,故极性生长并不是一开始就有的特性，而是在非极性(各向同性)生长过后才出现的。在不利条件下有些真菌的极性生长(非各向同性)被无限地推迟。,菌丝生长过程,黑曲霉的孢子在44下生长，它继续膨胀，形成巨细胞。如这时再转移到30下生长，它会表现得很特殊。从巨细胞中伸出芽管，随后形成孢子，见图1-37。,菌丝生长过程,菌丝生长过程,这说明在孢子膨胀期间黑曲霉也能正常地成熟，甚至产生孢子，只是要等到适合于极性生长时机才能表达这种潜在能力。,菌丝顶端生长过程,研究顶端生长过程的另一种实验方法是用水浸没镰刀菌菌落，观察其顶端生长情况。,菌丝顶端生长过程,菌丝顶端生长过程,结果有半数菌丝末梢停滞1 分钟后重新生长，只是在膨胀的菌丝顶端长出较细的菌丝。其余菌丝停止生长几分钟后在菌丝顶端又长出一个以上的较细的芽。,菌丝顶端生长过程,重复以上试验，但这次加水后,等40秒，再加入等渗溶液(即与琼脂的渗透压一样的溶液)。这会使它膨胀，暂停出芽。过后又长出一个以上的细芽。,菌丝顶端生长过程,这些现象说明，生长可能包含两个过程:1) 塑性顶端的延伸：2) 细胞壁的硬化，即随顶端延伸后的硬化。,菌丝顶端生长过程,在正常生长情况下这两个过程以同样的速率进行，只是硬化紧随顶端延伸之后，故总是只有一小段延伸区域呈塑性。,菌丝顶端生长过程,菌丝浸水试验的第一种情况可解释为浸水后生长延伸停止，菌丝顶端在重新调整其新的渗透压期间，细胞壁的硬化继续进行，在顶端还未完全封住前，在剩下的还未硬化的当中塑性部位继续长出一细芽；,菌丝顶端生长过程,对第二种情况，生长再次受到干扰，耽误了在剩余部位出芽的时机，最终顶端全被封住。这期间胞质继续流动的结果菌丝顶端膨胀，过几分钟便会在其它薄弱部位找到突破口，抽出一个以上完全新的细芽。,菌丝顶端生长过程,细胞壁的硬化是指胞壁的加厚或完全新的细胞壁的沉着, 而塑性顶端的延伸要靠溶解酶类的作用才能实现。 因此，如这些酶不稳定，或被蛋白酶降解，或因渗透压改变，阻止泡囊与菌丝顶端的结合，结果便出现胞壁的硬化。,菌丝分枝规律,菌丝分枝一般离生长着的菌丝顶端有些距离的后方进行。真菌如同高等植物那样显示出顶端生长的优势。但怎样维持这种优势知道的很少。,菌丝分枝规律,菌丝分枝一般均朝向菌落的边缘扩展生长， 并偏离其亲本菌丝和相互岔开生长。,菌丝分枝规律,这是多余的细胞质用于生长的结果，并且在细胞质体积，核分裂和分枝数目之间存在着明显的关系。在其它真菌中也确定了细胞体积和分枝之间的类似关系。,分枝的形成,分枝需要从已成熟的细胞中产生。这伴随着泡囊在菌丝顶端的聚集。分枝在菌丝的哪一部位产生? 这似乎有一中意点, 往往位于间隔的附近。通过试验可证实这一点。,完整菌丝断片的出芽位置,Figure 3. Integrated model for the formation of aerial hyphae in the filamentous bacterium Streptomyces coelicolor. (a) Extracellular signalling and environmental signals exert the Ir influence on development through the bld cascade. This cascade induces the formation of Ram R, the chaplins ChpE and ChpH(redcircles), and components of the sky pathway, such as a sensor of aerial growth (bluecircles). Ram R activates the synthesis of RamS, which is converted to SapB (yellowcircles). This morphogenetic peptide is secreted by the RamA B transporter purpleovals) and, together with ChpE and ChpH, initiates aerial growth by lowering the water surface tension. (b) From this moment, the sky pathway takes over regulation of development. This pathway would include a sensor of aerial growth (bluecircles). As a consequence,the rodlin and chaplin genes, and probably other genes, are activated. Rodlins (green circles) and chaplins (red circles) assemble into ahydrophobic rodlet coat at the outer surface of aerial hyphae.This layer provides surface hydrophobicity and prevents aggregation of aerial hyphae. The insert shows the typical appearance of the rodlet layer, as assessed by scanning electron microscopy.,分枝的形成,将菌丝打碎，只要得到含有完整间室的碎片，便能如图1-39 那样产生新的分枝。新分枝总是产生在这些碎片的靠间隔处，故即使在菌丝内其个体细胞也有某些程度的极性。,菌丝生长单位(hyphal growth unit) G(=m),G 菌丝总长度/菌丝分枝数目 经最初的波动后G随菌落的生长而变化。因此，分枝的数目总是与菌丝总长，从而与细胞质的体积成正比。 由此可见，新分枝是在胞液体积超过现有分枝数所能容纳的体积时产生的。,菌丝生长单位,在琼脂中生长的不同阶段摄下年轻菌落的发育照片，按公式可求的菌丝生长单位（G）,菌丝生长单位,从生长单位的确立可看出胞液体积与分枝之间有如下规律：1) 每一分枝连同其有关的一定量的细胞质可当作一个菌丝单位(unit)，就像对待个体细胞，如酵母那样。故一真菌菌落是靠假想的单位生长的。实际上它们是连在一起，分不清的；2) 由于新的分枝是多余细胞质形成的，分枝的数目基本上取决于菌落的营养状况，从而取决于细胞质的数量；,菌丝生长单位,3) 因现有的分枝能优先得到细胞质，故一分枝的形成对已有的分枝的生长速率影响很小；4) 真菌菌落容易适应一定范围的养分浓度变化。它在养分贫乏的琼脂培养基中散开的速度几乎同丰富培养基上的一样，但分枝少一些。,菌丝生长单位,菌丝生长单位,生长初期，菌丝总长度和分枝数目均以指数的速率增加，这时的菌丝体间隔较长。菌丝生长单位的变化幅度随生长而减小，最后稳定。,微生物生长分化的调节,微生物的生长分化受其自身和外界多种因素的调节。以真菌为对象阐述菌丝体形态的调节。以下的规律主要适用于固体培养基上生长的未分化菌丝。,微生物生长分化的调节,真菌孢子在培养基上发芽，形成未分化的菌丝，继续生长，分化为成熟的菌丝。,微生物生长分化的调节,丝状菌的形态上的优势:菌能无限扩增而无需改变细胞质的体积与表面积之比；菌丝体与培养基之间的物质交换只需通过较短的距离；菌丝以有规律的分枝确保它能高效地复盖在固体培养基上。,微生物生长分化的调节,微生物生长分化的调节,未分化菌丝的生长调节至少包含三种机制,1)菌丝极化的调节 生长是极化的, 菌丝的伸长仅限于菌丝顶端；2)分枝启动的调节 芽管伸长，形成主杆菌丝, 并由此形成初级分枝, 再由此形成次级, 一直分枝下去。从菌丝体的形态特征说明存在着一种调节分枝启动频率的机制；3)菌丝空间分布的调节 未分化菌丝趋向于分散独立生长，相邻菌丝间的接触因 回避作用 而减少。这称为向自性 (autotropism)。,极化生长的调节,菌丝极化生长是指孢子或菌丝细胞的一端发芽，伸长，长成菌丝。培养条件，如温度不适，或在厌氧，含CO2浓度较高的条件下会阻止极化生长，并以非极化(即各向同性)方式, 像酵母那样生长。非极化生长是与不利的生长条件相联系的。,极化生长的调节,菌丝极化生长受若干内源调节机制的控制。菌丝生长(孢子发芽，顶端生长，分枝)总是与泡囊的活动相联系。 调节是通过向菌丝顶端输送泡囊，泡囊与细胞膜融合发挥作用的。 扰乱这两种作用会导致各向同性生长。,菌丝分枝启动的调节,从孢子发芽后未分化菌丝体起先在大致恒定的环境条件下生长，随后其生长环境，即培养基的物化条件有较大的改变。在固体培养基上菌丝体的初期生长阶段与分批培养的初期指数生长条件相似，所形成的菌丝也基本相同。以下的分枝启动规律除特别注明外均指未分化菌丝。,微生物生长分化的调节,菌丝平均伸长速率(E) E=2(Ht-H0) / (BtB0) = G (1-36)Ho和Ht分别为零和1 h的菌丝体的总长度； Bo和Bt分别为零和1 h的分枝数目。G 为菌丝生长单位；为比生长速率。在标准的培养基中测定不同霉菌的E，其标准偏差不超过12%。,微生物生长分化的调节,E是未分化菌丝的分类特征，见表1-22。 未分化菌丝体的总长度起初以指数速率增长，直到菌丝体总长超过15 mm (以冻土毛霉为例)为止。 接下去是生长速率的累进期。,微生物生长分化的调节,指数期的长短通常受霉菌菌丝生长单位的影响，如形成稠厚菌丝体的产黄青霉(G =48m) 比形成稀疏菌丝体的冻土毛霉(G = 95m)减速早一些。 这大概与培养基成分的不利变化，如pH，次级代谢物或养分浓度的变化，和菌丝体的分化有关。,微生物生长分化的调节,环境条件对菌丝生长单位（G）的影响,a 温度 菌丝生长单位不受温度的影响，和E均随温度的改变而以相同的速率变化，即E/为一常数。故温度影响菌丝生长单位的复制速率，而不是长度。,环境条件对菌丝生长单位的影响,b 培养基成分 营养成分的改变会影响G和，但对E的作用不大，从表1-23可见，不同培养基对的影响恰好与对G的影响相反。,环境条件对菌丝生长单位的影响,环境条件对菌丝生长单位的影响,c 分枝诱导剂 L-山梨糖抑制粗糙链孢霉的E，对影响不大，因而使G下降，诱导粗糙链孢霉茂盛分枝。用L-山梨糖处理过的的菌丝体，其max保持不变，但其空间分布改变，霉菌以群生(成团)或半群生方式生长。,环境条件对菌丝生长单位的影响,d 抑制剂 霉菌生长抑制剂对G的影响取决于抑制剂的性质和剂量，如G不受影响，说明这种抑制剂同时影响E和，因而G = E /不变。 环己酰胺则会使G减小。,菌丝空间分布的调节,菌丝倾向于散开单独生长，部分原因是向自性(autotropism)的结果。向自性是一种确保同类菌丝高效地覆盖固体培养基的机制。,菌丝空间分布的调节,对这种现象有两种解释：1)菌对聚集于环境中的未知因素的负向化性反应； 2)对氧或其它营养要素的正向化性反应。 所谓向(趋)化性是指一种以化学物质为刺激源的向性，负则表示避开的意思。,二、微生物生长环境（Environment of Microorganism Growth）环境因子：温度(Temperature)、 酸碱度（pH）、 渗透压、 水的活度(Activity of water)、 压力(Pressure)等,(h-1) 嗜冷菌 中温菌 嗜热菌 026 1543 3765 T()从上图可知：（1）任何微生物生长温度范围都小于30；,（一）、温度对生长的影响,（2）生长速率随温度的升高而缓慢增加，直到达到最高的生长速率；(3)超过此值时生长速率随温度的进一步提高而讯速下降。(4)温度与生长的关系符合Arrhenius方程： When Growth: Specific Growth Rate =Ae- Ea/RT When Death: Specific Death Rate =Ae Ea/RT (where Ea=1530Kcal/Mol, Ea=6090Kcal/Mol ) Growth Modelling: dX/dT=X-X,问题（Questions）:1.如何解释最适生长温度与最适产物形成不一致？ 2.如何解释获得最大比生长速率（max）温度与获得最大菌体得率系(Yx/s)数温度不一致？,（二）pH对生长的影响 (h-1) pH 图 pH与微生物生长关系图Fig. Relationship of pH and Cell growth由上图可知：（1）微生物生长一般的pH范围为36，不超过8.5； （2）最大生长速率时的pH变化范围为0.51；从上二图可知pH与最适温度之间关系：生长最适温度高的菌种，其最适pH也高。,参数变化： pH上升超过最适值，表示细胞处饥饿状态，需补加碳源，补糖过量又会下降；pH控制策略：（1）补氨水，但过量氨水会使菌体中毒，引起呼吸速率急速下降，即CER下降； （2）控制补碳源速率,pH动态变化,溶氧（DO）,（a）气泛状态（b）气载状态（c）完全分散态,气 体,C*P/H, 与气相中氧分压相平衡的液体中氧的浓度 H:亨利系数,Kl: 以氧浓度为推动力的总传递系数 (m/h),再令：单位体积的液体中所具有的氧的传递面积为 a (m2/m3),Nv：体积传氧速率 kmol/m3.hKla: 以(C*-C)为推动力的体积溶氧系数 h-1,二、发酵液中氧的平衡,发酵液中供氧和需氧始终处于一个动态的平衡中,传递(OTR)：,消耗(OUR)：,OUR= QO2 .X,氧的平衡最终反映在发酵液中氧的浓度(DO)上面 DO = OTR- OUR,Oxygen trnsfer rate, OTR,OUR与氧传递,菌体与氧传递,氧传递,氧传递,氧传递= f( T R P F 菌体形态 亲和常数 代谢活性),徐庆阳等 微生物学通报，2007,5%,20%50%70%,谷 氨 酸 发 酵,产酸 转化率标准(40-50) 122.0 63.7%低 (20左右） 115.2 57.0%,徐凯等，中国调味品，2007,郜培等，食品工业发酵，2005,郜培等，食品工业发酵，2005,GLU,OD,a-KG,过程分析,（三）渗透压对生长的影响 根据耐受盐浓度的大小可将微生物分为四类： A. 非嗜盐菌 0-1.0g/L; B海洋细菌 0.15.0g/L; C. 中等嗜盐细菌 2.3-20.5g/L; D. 极端嗜盐菌 12-36g/L(饱和),一般耐渗透性越强的细菌细胞内与胞外K+浓度之比越大，例如：1. E.coli K+吸收能力增加，细胞内渗透压亦增加，这了维持大致恒定的离子强度，于是排出腐胺，2.甘油发酵，则利用耐高渗透压酵母进行，代谢途径为： 葡萄糖 6-磷酸葡萄糖 1,6-二磷酸果糖 戊糖途径（HMP Pathway） 丙酮酸 磷酸二羟丙酮 TCA 厌氧CO2 乙醇 甘 油 多 醇 图 甘油代谢示意图（Glycerol Metabolic Pathways）,阿卡波糖由游动放线菌(Actinoplanes sp .SE 50)产生。对肠道内的蔗糖酶、麦芽糖酶、糊精酶和葡萄糖淀粉酶都有强烈的抑制作用，并对a一淀粉酶有微弱的抑制作用。,aC7N单位 b4,6-二脱氧己糖,c麦芽糖,阿卡波糖由阿卡波糖特征基团acarviose和麦芽糖组成，acarviose由双脱氧葡萄糖和有效霉胺（即不饱和氨基环醇C7N结构）两部分组成。,氨基环醇（a组分）来自于磷酸戊糖途径中的7磷酸景天庚酮糖,转化酶由abcC、M、O、R编码。其中