噬菌体与杂菌的防治

5 噬菌体与杂菌的防治,在发酵工业中常存在噬菌体和杂菌的污染，噬菌体污染会使生产菌发生自溶而危害生产。杂菌污染消耗大量营养，破坏原有营养条件，导致生产菌营养不足；产生代谢产物改变环境的理化条件，抑制生产菌形成产物；破坏发酵产物或将其当营养消耗而造成目的产物损失。因此，污染直接影响发酵产物的产量，甚至导致倒罐而一无所获。染菌还会影响产物的提取从而影响产品质量。由此可见，控制谷氨酸发酵生产，必须防止噬菌体与杂菌污染，只有杜绝污染才能实现发酵工艺的最优化控制。,5.1 谷氨酸发酵中噬菌体的污染与防治 噬菌体是侵染细菌、放线菌等微生物并使其细胞裂解死亡的一类病毒。它个体微小，必须用电子显微镜才能观察到。噬菌体无细胞结构，但具有一定的形态结构。其基本形态为蝌蚪状、微球状和丝状，多数呈蝌蚪形，由头部和尾部两部分组成。,有的味精厂往往由于发酵污染噬菌体而造成倒罐，使生产紊乱，甚至短期停产。多年来，国内外味精生产厂商都很重视对噬菌体的防治工作，并采取了一系列防治措施，使噬菌体污染得到基本控制，污染程度也逐步减轻，但尚未达到根治。往往轻度的噬菌体污染也会使正常生产受到困扰，并使产率下降，成本升高，对企业效益影响很大。所以，对噬菌体的防治仍然是发酵工业普遍关注的问题。,1961年在我国台湾的谷氨酸发酵工厂中最早发现噬菌体，其后1963年在日本的八代工场，乳糖发酵短杆菌No.2256即ATCC13869菌株发生溶菌现象，并从发酵罐中分离出P系噬菌体，从空气中分离出AP系噬菌体。我国是在1966年发现黄色短杆菌和北京棒杆菌AS1.299菌株污染并分离出A系噬菌体。,噬菌体的本质 噬菌体是病毒的一种，是一种极微小的生物，可能通过细菌过滤器，只有在电子显微镜下才能看到；能够繁殖，具有非常专一寄生性，可以认为是细胞以外的一种分子生物。 噬菌体的化学组成 绝大部分是DNA和蛋白质，占噬菌体重量的90%以上。少数为RNA。,5.1.1 噬菌体的化学组成,核 酸 绝大部分是DNA，少数是RNA.蛋白质 外壳核酸和蛋白质占总质量的90%以上,5.1.2 噬菌体的形态,从形态学上可将噬菌体分为六群,噬菌体的形态和构造 在电子显微镜下可以观察到噬菌体的形态，其形态有蝌蚪形、微球形和纤维形等六种，以蝌蚪形为大多数。谷氨酸产生菌的噬菌体基本上是蝌蚪形。已发现的谷氨酸产生菌如乳糖发酵短杆菌和产氨小杆菌所感染的噬菌体都是多面体头部和不短的尾部。头部长50200nm，宽50200nm，尾部长250600nm。噬菌体直径为0.1m，为细菌大小的1/10；体积是细菌的1/1000。,表5-1 噬菌体的形态,细胞壁,5.1.3 谷氨酸发酵中的噬菌体,目前我国谷氨酸发酵中所发现的噬菌体，均属蝌蚪形。,5.1.4 噬菌体的生活史,吸附 侵入 复制成熟 释放,噬菌体缺乏独立代谢的酶系，不能脱离寄主而自行生长繁殖；缺乏细胞结构，是非细胞类型。它的生长繁殖包括吸附、侵入、复制和成熟四个阶段。,5.1.4.1 吸附,噬菌体的吸附器官与受体细胞特殊位点的接触。对于T类噬菌体的吸附器官是尾丝和尾钉，尾丝首先触及寄主细胞表面，然后尾钉固定。寄主的专一性和吸附位点的专一性。,吸附 敏感的细菌细胞壁上具有吸附噬菌体的特异性受点，噬菌体尾部由此吸附侵入。在吸附时，一般必须存在Ca2+、Mg2+等阳离子。 Ca2+、Mg2+是噬菌体的激活剂和吸附剂，促进噬菌体的吸附作用，而Fe2+、Cu2+对吸附有抑制作用。,5.1.4.2 侵入,噬菌体核酸物质进入受体细胞。对T类噬菌体就开始收缩尾鞘，结果不仅尾髓插入细胞壁，而且会像注射一样将DNA打入细胞内。蛋白质的外壳仍在壁外，而线状噬菌体fd则全部进入寄主细胞。,侵入 噬菌体尾部的前端含有溶菌酶类，当吸附后尾髓贯通细胞壁，尾鞘收缩，将头部的DNA（或RNA）射入细胞内。从吸附到侵入时间很短，一般只要几分钟。,5.1.4.3 复制,噬菌体核酸物质及蛋白质在寄主细胞内的合成,噬菌体的DNA进入细胞后，起着支配的作用，大量复制子代噬菌体的DNA以及噬菌体的蛋白质，并形成完整的噬菌体。,5.1.4.4 成熟(装配),在增殖期合成的噬菌体的核酸和蛋白质按一定的顺序装配成噬菌体颗粒。,成熟 噬菌体DNA的合成从感染后57min开始，其速率竟为细菌本身DNA合成的510倍。810min时头部蛋白质、尾髓、尾鞘、尾丝等合成依次开始，1012min在细胞内开始出现成熟的噬菌体。,5.1.4.5 释放,噬菌体繁殖的最后阶段是裂解释放出子代噬菌体。裂解细胞要涉及两个或更多基因的作用,一个作用于细胞膜，另一个分解细胞壁,线状噬菌体则不裂解寄主细胞，可能是通过挤压而冲出细胞壁。,从吸附到放出时间叫潜伏期，一般为30120min。每个细胞放出的噬菌体的平均数约为8150个。,5.1.5 典型的噬菌体一步生长曲线,5.1.6 潜伏期、潜隐期、裂解期、裂解量,潜伏期 从噬菌体吸附细菌细胞至细菌细胞释放出新的噬菌体的最短时间。潜隐期 从噬菌体吸附细菌细胞到细胞内从新出现噬菌体的颗粒的最短时间。,裂解期 从被感染的第一个细胞裂解至最后一个细胞裂解完毕所经历的时间。 裂解量 每种噬菌体侵入敏感细胞，平均每个细胞最后能装配完成和释放出的噬菌体数称为裂解量，它是相对固定的。,5.1.7 裂解量的计算公式,a 裂解期末平均噬菌斑数 b 潜伏期平均噬菌斑数,裂解量=a/b,5.1.8 噬菌体的检测方法,单层平板法双层平板法液体培养检查法平板交叉划线法载玻片快速法增殖检查法快速检测法小剂量剌激检查法,噬菌斑 在细菌菌苔平板上，由于噬菌体感染，使寄主细胞不断裂解而形成的肉眼可见的空斑。空斑中的细菌被全部或部分裂解。,噬菌体具有非常专一的寄生性，而且噬菌体的繁殖必须依赖于寄主细胞的繁殖，只能在活的、正在繁殖阶段的细胞中繁殖；而在死的、衰老的、处于休眠状态的细胞中，或在代谢产物或培养基上均不能繁殖。,利用双层琼脂法形成噬菌斑,噬菌体的纯化和噬菌斑的形状,5.1.9 溶源性细菌与温和性噬菌体,烈性噬菌体 噬菌体侵入细菌细胞后，增殖很快，在较短时间内使细菌裂解。一般称这种噬菌体为烈性噬菌体。在谷氨酸发酵生产中遇到的多数为烈性噬菌体。,溶源性细菌和溶源性检查溶源性细菌 有些细菌遭受噬菌体侵入后，并不立即裂解死亡。噬菌体侵入细胞后和寄主的遗传物质紧密结合一起，在没有再度感染的条件下，能随着细胞的繁殖，在子代细菌中代代相传，不断延续，这种细菌称为溶源性细菌。溶源性细菌通常可以自发地释放噬菌体，每一代有10-210-5细胞发生裂解，释放出具有感染能力的噬菌体。溶源性检查 溶源性检查 在琼脂平板培养基上涂布指示菌，干燥后用接种环点2025个被检菌培养液，经UV照射后培养，检查溶菌斑。,温和性噬菌体 产生噬菌体的潜在能力称作为溶源性，将具有溶源性的细菌称作为溶源性细菌，它所产生的噬菌体称温和性噬菌体，也称溶源性噬菌体。温和性噬菌体形成的噬菌斑是浑浊的，因为中央有溶源性细胞生成。反之，某些突变所形成的噬菌斑是清晰透明的。一般常规平板法很难把温和性噬菌体检查出来，只有在适当条件下转化为烈性噬菌体才易查出。,5.1.10 谷氨酸发酵噬菌体的主要特性,具有非常专一的寄生性 谷氨酸产生菌噬菌体必须在专一的寄主细胞中生长繁殖，不能脱离寄主而自行生长繁殖，也不能在培养基上增殖，只有在活的、处于繁殖阶段的寄主细胞中生长繁殖。不耐热 不同噬菌体对热稳定性是不同的，但一般噬菌体都是不耐热的，会受热变性死亡。一般谷氨酸产生菌在6065下10min全部致死，其噬菌体在70510min全部致死。,对pH 的稳定性 在pH7.09.0时稳定，在pH6.0以下和pH10.0以上时不稳定，容易失活，小于pH4.0时，完全失活。嗜氧性 在低溶氧的条件下，其活性被抑制。,干燥条件下的稳定性 在非常干燥的状态下，5个月以上仍然稳定。噬菌体在干燥状态（相对湿度10%、30）比在湿润状态（相对湿度90%、30）稳定。不耐药性 对药物很敏感，0.5%甲醛、0.5%苯酚、1.5%漂白粉、1%石灰、1%双氧水、0.5%高锰酸钾、1%新洁而灭，都可使谷氨酸产生菌噬菌体失活。,传播性 由于噬菌体极小，质量很轻，存活期长，所以地面上一旦存在噬菌体，则在一定范围的空气中必有噬菌体，空气流动使噬菌体得以传播。在UV照射下失活 在液层5mm，距UV-15W灯15cm，照射2min，噬菌体完全失活。,5.1.11 噬菌体的感染途径和感染规律,噬菌体在自然界中分布很广，在土壤、污水、腐烂的有机物和大气中均有存在，凡是有寄主细胞的地方一般都存有它们的噬菌体，发酵车间、提取车间及周围更有机会积累噬菌体。造成噬菌体污染必须具备三个条件：有噬菌体；有活菌体；有使噬菌体与活菌体接触的机会和适宜条件。,感染噬菌体的最初发源点：一是菌株携带噬菌体或菌株本身就是溶源性菌株。生产上使用的原始菌株本来就是由自然界筛选得到的，由于一部分溶源性细胞诱发成温和噬菌体，再经过变异就有可能成为烈性噬菌体，导致使用菌株感染，引起危害。更主要的原因是把活菌体排放到环境中，使生产环境中存在的噬菌体有寄主而不断增殖，结果使环境中噬菌体的密度增高而形成污染源。此外，活菌体与其有关的其它溶源性菌株接触，经过变异、杂交，最终发生使生产菌株溶菌成烈性噬菌体，逐渐增殖，污染环境。,一般来说，当环境中噬菌体浓度达到102103PFU/mL，种子罐的噬菌体浓度达到104PFU/mL，主发酵罐的噬菌体浓度可达到106107 PFU/mL；严重溶菌时，其浓度甚至可达1010PFU/mL以上。,5.1.12 谷氨酸发酵感染噬菌体时出现的主要症状,发酵液光密度（OD）在初期不上升或回降pH逐渐上升且不再下降耗糖缓慢或停止，周期延长，提取困难产生大量泡沫、发酵液粘度大、发红、发灰谷氨酸产量甚少，或者增长极为缓慢,镜检革兰氏染色呈红色碎片，找不到完整细胞平板检查有噬菌斑菌种对营养要求增大，但培养时间仍然延长发酵后期感染时，有时产酸反而提高，这可能因噬菌体使菌体破坏而释放出细胞内谷氨酸的缘故提取时难中和，谷氨酸呈糊状或泥状，分离困难，收率低。,5.1.13 噬菌体的防治措施,净化生产环境、消灭污染源严格控制活菌体排放搞好环境的监测预报彻底搞好全厂性卫生，加强环境消毒车间合理布局铺设厂区道路，路面光滑搞好厂区绿化。,改进提高对空气的净化能力高空采风，空压机的采风口应设在30m以上采用高效空气过滤器，如英国DH公司、美国Poll或Milipore公司的高效空气过滤器，可以净化0.01m杂质（含0.3m的细菌和0.04m的噬菌体），过滤效率达99.9999%。,保证纯菌培养、做到种子本身不带噬菌体对保存的生产菌种要定期分纯，防止菌种退化。分纯的优良菌种可用真空冻干法保存。对菌种进行诱发处理，如果属溶源性菌株，经过诱发处理，使其释放出噬菌体。严格隔离措施。菌种室、无菌室与发酵车间隔离；减少菌种室与外界的接触。菌种室要经常进行噬菌体检测。加强对各级种子噬菌体检测。,轮换使用不同类型的菌种 噬菌体对寄主菌有专一性，某一菌种停止使用一段时间后，由于阳光、干湿度的影响，再加上药物消毒，会减少环境中噬菌体的密度，甚至完全消灭。因此可能轮换不同类型的菌种。,使用抗噬菌体的菌种 选育出来的抗噬菌体菌种应经常检查抗性，防止再度感染新噬菌体而丧失抗性。 改进设备装置、消灭死角,5.1.14 感染噬菌体的挽救,并罐法 利用噬菌体只能在处于生长繁殖细胞中增殖的特点，当发现发酵罐初期污染噬菌体时，可采用并罐法，即将其它罐批发酵1618h左右的发酵液，以等体积混合后分别发酵，利用其活力旺盛的种子，不进行加热灭菌，亦不须另行补种，便可正常发酵。,轮换菌种或使用抗性菌种 发现噬菌体后，停止搅拌，小通风，降低pH，立即培养要轮换的菌种或抗性种子，培养好后接入发酵罐，并补加1/3正常量的玉米浆（不调pH）、磷酸盐和镁盐。,放罐重消法 发现噬菌体后，放罐，用盐酸或硫酸调pH 不能用磷酸，补加1/2正常量的玉米浆和1/3正常量的水解糖，适当降低温度重新灭菌，接入2%种子继续发酵。,罐内灭噬菌体法 发现噬菌体后，停止搅拌，小通风，降低pH，间接加热到7080，并自罐顶接种管道或加消泡剂管道内通入蒸汽，自排气口排出。因噬菌体不耐热，加热可杀死发酵液内的噬菌体，通蒸汽杀死发酵罐上部空间及管道内的噬菌体。冷却后如pH过高，停止搅拌，小通风，降低pH，接入2倍量以上的原菌种，至pH正常后开始搅拌。,当噬菌体污染情况严重，上述方法无法解决时，应调换菌种或停产全面消毒，待环境噬菌体密度下降后，再恢复生产。,5.2 谷氨酸发酵中杂菌的检查与防治,所谓杂菌污染，是指在发酵过程中生产菌以外的其它微生物侵入了发酵培养液。几乎所有的发酵工业，特别是通风发酵，都有可能遭受杂菌的污染。染菌结果，轻则产酸下降，重则导致倒罐。谷氨酸发酵要求纯种发酵，在整个发酵过程中必须防止杂菌的侵入。尽管谷氨酸周期不长，但是由于培养基营养比较丰富，产物又无抑菌能力，因此各个环节均须加强控制，严格无菌操作。,5.2.1 染菌原因分析从染菌的时间分析 早期染菌：可能是由于种子带菌，接种操作不当或培养基灭菌不彻底，环境污染和设备因素所致。中、后期染菌：多数是空气过滤不严或泡沫顶盖、设备渗漏、补料操作不当引起。,从污染的杂菌类型分析污染耐热芽孢杆菌：多数是由于培养基灭菌不透或设备存在死角所造成。污染球菌、细杆菌等：主要来自空气系统净化效率低或由于阀门渗漏。,感染霉菌：多数是由于无菌室灭菌不彻底或无菌操作不当造成。感染酵母：主要来自糖液灭菌不彻底，特别是放置时间较长的稀糖液。,从染菌的幅度分析 多数发酵罐大面积染菌：早期染菌，可能是种子带菌或连消设备存在问题；中、后期染同一菌，很可能是空气过滤器除菌不净，空气带菌。个别发酵罐连续染菌：多数是由于设备问题造成的，如阀门渗漏、盘管穿孔等。,5.2.2 检查杂菌的常