Western操作步骤.doc

Western-Blot 操作流程（一） 组织中总蛋白的提取用干净的剪刀剪取绿豆大小的组织块于1.5ml的EP管中，加入200uLRIPA裂解液(含PMSF，比例为97：1：1：1)，用杵子研磨3-4min,直至组织完全溶于裂解液（注意：杵子下2/3段事先在酒精里浸泡至少30min，用之前用滤纸吸干酒精，），以上过程均在冰上操作。研磨好组织后均在振荡机上振荡20-30s,每隔5min再次振荡，重复3次。然后在 4下12000rpm 离心 5min，取上清分装于 1.5mlEP管中并置于-80冰箱保存。（二）BCA法蛋白含量的测定(1) 从-20取出 1mg/ml BSA，室温融化后，备用。(2)取96孔板，按以下表格分别加入相关试剂：PBS(uL)+BSA(uL)40+038+236+432+824+1616+248+320+40PBS(uL)+样本(uL)39+139+139+139+139+139+139+139+1注意：加不同的样本时注意更换枪头(3)以上步骤完成后，在所有加样的孔里各加上200uLBCA蛋白浓度测定试剂（按试剂A：试剂B=50：1的比例配置），然后置于37水浴锅30min后取出。(4)酶标仪测定OD值。(5)EXCEL表格制作标准曲线，按照标准曲线计算各样本的蛋白浓度。（三） 稀释蛋白及蛋白变性如果计算出的样本的蛋白浓度偏高，需要用RIPA裂解液将蛋白稀释（一般将蛋白浓度稀释至5-10ug/uL）;稀释完后取10-30uL的样本蛋白置于新的1.5mLEP管中，加入新EP管中总体积1/4体积的上样缓冲液，置于99-100的干式恒温器中加热5-10min,使蛋白变性。（注意：将EP管的盖子盖紧，插入加热器的大圆孔中）煮过的蛋白置于-20冰箱保存。（四） 制作SDS电泳胶 清洗玻璃板，双蒸水冲洗晾干后，根据厂家说明安装玻璃板。 配置10%的分离胶 配方：H2O2 4.0ml 30%丙烯酰胺液 3.3ml 1.5mol/l Tris （ PH8.8） 2.5ml 10%SDS 100ul 10%过硫酸胺 100ul TEMED 4ul 分离胶溶液中加入 TEMED 以及 10%过硫酸胺后需立即混匀（防止未灌胶就 发生凝固），将混合液立即加入玻璃板内，距梳子下缘约 lcm 处即可，蒸馏水封顶，待凝胶完全聚合（约30min）后，倒去双蒸水。 制备5%的浓缩胶 配方；H2O2 3.4ml 30%丙烯酰胺液 0.83ml 1.5mol/l Tris （ PH6.8） 0.63ml 10%SDS 50ul 10%过硫酸胺 50ul TEMED 5ul(5)将所剩余空间加满浓缩胶，迅速将梳子插入浓缩胶中，室温放置约10min，待浓缩胶凝固后，轻轻将梳子拔出。（梳子也可在电泳液中拔出）（五） SDS-PAGE 电泳（1）按厂家说明组装好电泳槽，在电泳槽中加满电泳液后开始上样（上样枪上样）；将准备好的蛋白样品和预染的蛋白质分子量标准品分别上样，注意切勿将样品溢出孔外。（注意：样品的准备：每孔配制含 50g 总蛋白的样品，按照组织中目的蛋白含量的多少调整上样量）（2）接通电源开始电泳；80V 恒定电压下电泳30min，然后改为140V 恒定电压电泳1 小时；待溴酚蓝条带至凝胶底端时停止电泳。（六） 转膜（1）小心的从玻璃板上取下凝胶，切除所有浓缩胶及最下端的溴酚蓝条带（注意动作轻柔，保证凝胶的完整性）。将凝胶转移至转膜液中浸泡约 15min；同样，滤纸在转膜液中浸泡至少30s；准备好的硝酸纤维素膜（ NC 膜）浸入转膜液中 15min。(2)制备夹层“三明治”： 按照下列顺序排列：海绵垫滤纸凝胶NC 膜滤纸海绵垫，注意要 逐层排放，每层需要排空气泡，以免影响转膜效率。(3)将已经做好的“三明治”夹子放入转移槽中，使黑色面对准电泳槽的黑色面； 由于转膜时会产生大量热量，在电泳槽周围需要放置冰壶用以降温。将转移装置置于冰中，打开电源，调节电压至 100v，转膜时间 90min。 （七） 显色和剪膜转完后将膜用 1丽春红染液染至可以看到蛋白条带,将膜放入TBST液体中，对照蛋白maker条带用直尺标出目的蛋白的范围并剪下，将丽春红染液洗净，膜晾干备用。（八） 膜的免疫反应（1）封闭：将晾干的膜移至含有封闭液（5%脱脂奶粉）的平皿中，室温下脱色摇床封闭1-2小时。（2）倒掉封闭液，附上一抗，用保鲜膜裹在平皿上，置于4冰箱过夜。（3）第二天将平皿置于摇床上摇15-30min，将一抗回收，TBST液洗膜3 次，每次 5min；随后加入 HRP 标记的二抗，室温摇床上孵育1 小时；紧接着回收二抗，用TBST 洗膜 3 次，第一次10min,随后两次各5min。（九） 化学发光、显影、定影（1）准备工作：将化学发光试剂盒中两种试剂等比例混合为反应液（注意避光）。（2）将洗涤好的 NC 膜置于反应液中室温孵育 1-3min（避光）。（3）去除过量的溶液，将膜夹在两层保鲜膜之间，X 胶片曝光，根据荧光强度决定曝光时间（过程中注意避光）。Western Blot 整个操作流程中所用试剂生产厂家及编号RIPA裂解液（中） Beyotime P0013CPhosphatase Inhibitor Cooktall KANGCHEN KC-440.2BSA蛋白标准品（5mg/ml） Beyotime P0012-3BCA蛋白浓度测定试剂盒（A、B两盒） Beyotime P0012蛋白上样缓冲液（SDS-PAGE）(5* 15ml) Beyotime P0015L30%丙烯酰胺液（100ml） Beyotime ST0031MTris-Hcl（100ml）Ph8.8 Beyotime ST7881MTris-Hcl（100ml）Ph6.8 Beyotime ST76810%SDS（100ml） Beyotime ST628 TEMED Beyotime ST728APS粉末（Ammonium Persulfate） 生工生物工程（上海）股份有限公司（Sangon Biotech） A1004860025Tris碱（500g） Sangon Biotech A1008260500Glycine（500g） Sangon Biotech A1001670500SDS粉剂 Sangon Biotech A100227010020*TBS Concentrate(500ml) Sangon Biotech B548105-0500Tween-20 Sangon Biotech A1007770500蛋白质分子量标