十九章 DNA复制、修复与重组_第1页
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第十九章  DNA复制、修复与重组,第一节 DNA的复制总观,一、DNA的半保留复制1958年 Meselson 和 Stahl 应用同位素标记法和 CsCl 密度梯度超离心技术研究 E. coli DNA复制时，才证实半保留复制机制是正确的。用重氮（15N）标记的 15NH4Cl 作为唯一氮源培养E. coli 15代，使所有细菌 DNA 都带有 15N 标记，然后将这些细菌转移到含轻氮（14N）标记的 14NH4Cl 培养基上培养，按不同时间取样品，每个样品都用 SDS 裂解细胞，裂解液中 DNA 的密度借助平衡密度梯度超速离心来检测。（图19-1.ppt）,二、复制子、复制起始电与方向,（一）复制子的含义与方向基因组能独立进行复制的单元称复制子。对于原核生物复制子，它含有控制复制开始的起点包括其控制元件。一旦复制起始，随即延伸直至到达停止复制的终点，而完成整个复制子的复制。复制的方向大多是双向的并形成两个复制叉。少数是单向复制的，只形成一个复制叉（图19-2.ppt）。,第二节  原核生物DNA的复制,参与DNA复制的酶主要有DNA聚合酶和连接酶。E.coli DNA聚合酶有三种：DNA聚合酶、和。三种酶都具有多重酶活性（聚合、外切），催化的聚合反应速率有很大差别。,一、DNA聚合酶 I 的性质,E. coli DNA 聚合酶I是一个多功能酶，具有几种催化活性：DNA聚合酶活性，催化脱氧核糖核苷单磷酸（dNMP）掺入新生链中并按53 方向延伸；3 5核酸外切酶（一种校对活性），从3 端水解 DNA；53 核酸外切酶活性，从5端水解DNA，其功能为修复损伤的DNA和切除引物等；从3 端发生焦磷酸水解作用。,（一）DNA聚合酶I能催化DNA的合成,向聚合酶I制剂中，加入适量的DNA模板，在Mg2+存在下，同时加入四种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）底物：dATP，dGTP，dCTP和放射性标记的dTTP。在DNA聚合酶I催化下，脱氧核糖核苷酸被加到DNA的3末端，同时释放出无机焦磷酸。,（二）聚合酶 I 催化反应的特点,DNA聚合酶作用的底物必须是脱氧核糖核苷酸三磷酸dNTP而非其他；聚合反应是在模板 DNA 的指令下进行的；DNA聚合酶I只能在已有的核酸链上延伸 DNA，不能从头开始 DNA的合成，所以反应时必须有引物；dNMP参入到新链后，DNA聚合酶 I 必须解离或沿模板移动以利另一个 dNMP 参入；在DNA聚合酶I解离之前参入dMNP的数目被定义为持续合成能力，参入dNMP的数目可以从几个到几千；复制产物的性质与模板的相同；催化反应需要两价的金属离子；在离体实验条件下，进行 DNA 合成反应时，所用的模板不能是完整的双链，必须在单链上具有缺口或切口。,DNA连接酶,催化双链 DNA 切口的 5磷酸基和 3羟基生成磷酸二酯键。键的连接是需能反应。噬菌体和动物细胞的 DNA 连接酶不仅能将 DNADNA之间切口通过磷酸二酯键连接，也能连接无单
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