十一章 柠檬酸循环VIP

第十一章 柠檬酸循环,柠檬酸循环概貌,第一节 丙酮酸氧化进入柠檬酸循环的准备阶段形成乙酰CoA,一、丙酮酸脱氢酶复合体或丙酮酸脱氢酶系（由三种酶高度组合在一起） 参与反应的3种酶分别是：丙酮酸脱氢酶（E1）组分、二氢硫辛酰转乙酰基酶（E2）、二氢硫辛酸脱氢酶（E3）。辅助因子：辅酶A、NAD+、硫胺素焦磷酸（TPP）、硫辛酰胺和黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）等。,二、丙酮酸脱氢酶复合物催化的反应,丙酮酸脱氢酶复合物催化五步反应，其总反应是： CH3COCOO-CoASHNAD+CH3COCoA CO2NADH G=33 kJ/mol 在丙酮酸脱氢酶复合物催化的反应中涉及五种不同的辅酶，它们分别是焦磷酸硫胺素（TPP）、硫辛酸、辅酶A、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸。这些辅酶在该酶复合物催化反应中的功能列于表111中。丙酮酸脱氢酶复合物催化反应的顺序如图111所示。,（一）丙酮酸脱氢酶,丙酮酸脱氢酶（E1）在酶促反应中需要ATP。在该酶的催化下，丙酮酸脱羧，并产生羟乙基TPP中间物（见图）：该反应与酵母丙酮酸脱羧酶催化的反应相同。酶促反应产生的羟乙基在同一种酶的催化下，被转移到二氢硫辛酰转乙酰基酶的硫辛酰胺基上（图112）。,催化丙酮酸转变为乙酰CoA的反应步骤,（二）二氢硫辛酰转乙酰基酶,二氢硫辛酰转乙酰基酶（E2）催化一个转酯基反应。在该反应中，乙酰基被转移到CoA的巯基上，产生乙酰 CoA 和二氢硫辛酰胺E2：二氢硫辛酰转乙酰基酶含有一个硫辛酰胺残基，硫辛酰胺是由硫辛酸与该酶蛋白的一个Lys 残基的 氨基共价连接构成（图113）。硫辛酰胺参与酶促反应的部位是它的环状二硫化物。能可逆还原产生二氢硫辛酰胺。在丙酮酸脱氢酶催化下，由丙酮酸脱羧产生的羟乙基攻击硫辛酰胺的二硫化物，并使TPP释放出来。当硫辛酰胺的二硫化物被还原时，含负碳离子的羟乙基被氧化成乙酰基（图112）。,（三）二氢硫辛酰脱氢酶,二氢硫辛酰脱羧酶是整个丙酮酸脱氢酶复合物不可缺少的部分。尽管在上面的反应中乙酰CoA已经形成，但是与E2结合的硫辛酰胺必须重新产生，才能完成一次催化循环。二氢硫辛酰脱氢酶含有一个反应性的二硫键和一个精密结合的FAD。在该酶的催化下，二氢硫辛酰胺被氧化，并伴随着该酶本身的还原（如图）：还原性的二氢硫辛酰脱氢酶（E3）被FAD氧化，产生FADH2。接着FADH2上的电子在该酶的催化下转移给该酶的另一个底物NAD，生成NADH：,三、辅酶A是重要的酰基载体,辅酶A是维生素B3的衍生物。泛酸也是酰基载体蛋白的组分。泛酸在自然界分布广泛。辅酶A是由等摩尔的泛酸、核糖C3位具有磷酸基的ADP和巯基乙胺（图114）。辅酶A主要起着传递酰基的作用，分子中的SH可以接受或供出酰基。辅酶A与各种酰化反应有着密切的关系，是具各种酰化反应的辅酶。辅酶A主要起着传递酰基的作用，分子中的SH可以接受或供出酰基。因此，辅酶A与各种酰化反应有着密切的关系，是各种酰化反应的辅酶。酰化辅酶A的形成是分布进行的，涉及到酰基辅酶A的形成与转移。,第二节 柠檬酸循环,一、柠檬酸循环的发现柠檬酸循环也叫做三羧酸循环或者Krebs循环，完整的柠檬酸循环如图115所示。二、柠檬酸循环的反应历程柠檬酸合酶催化乙酰CoA与草酰乙酸的缩合，生成柠檬酸。这是柠檬酸循环的起始反应。柠檬酸合酶催化的反应遵循有序反应机制。X射线研究表明，柠檬酸合酶游离的二聚体呈现一种“开放”的形式，两个结构域形成一个裂缝，含有草酰乙酸的结合部位。在提出的反应机制中，柠檬酸合酶的三个可解离的侧链参与了催化反应（图116）。,（二）异柠檬酸的形成,柠檬酸在顺乌头酸酶的催化下，异构化转变成异柠檬酸。顺乌头酸是这一转变反应的中间物（见图）；该步反应是可逆的，G6.3 kJ/mol，反应有利于柠檬酸。因此，在平衡时，异柠檬酸大约只占10。柠檬酸是一种前手性分子，然而顺乌头酸酶却能对柠檬酸两端的两个相同的基团具有选择性。对这种选择的解释是：根据酶作用的立体专一性，酶分子活性中心是不对称的，有三个不同的结合部位，这三个不同的结合部位只有在与底物分子的三个不同的取代基互补时，该酶才能进行催化。柠檬酸的中心碳连接有四个取代基，其中两个是相同的。但是这两个相同的基团在空间取向上是不同的，也就是说在空间上是可以区别的（图117）。因此，当柠檬酸与顺乌头酸酶的活性部位结合时，酶活性部位的微环境能区别在空间取向上不同的两个相同的基团，使得两个相同的基团中只有一个被酶作用，而另一个则不能被酶催化。,（三）异柠檬酸的氧化脱羧,异柠檬酸脱氢酶催化异柠檬酸氧化脱羧转变成酮戊二酸。这是柠檬酸循环的第一步脱羧反应。反应中伴随NAD还原产生NADH。依赖于NAD的异柠檬酸脱氢酶也需要Mn2或者Mg2作为辅助因子。在该酶的催化反应中，异柠檬酸的二级醇羟基氧化，转变成草酰琥珀酸，接着位羧基发生脱羧反应，生成酮戊二酸（见图）。 Mn2在反应中起着使新形成的羰基极化的作用。,（四）酮戊二酸的氧化脱羧反应, 酮戊二酸在酮戊二酸脱氢酶复合物的催化下，氧化脱羧，产生琥珀酰CoA,同时释放出CO2和NADH（见图）。这里，释放的CO2同样来自原初的草酰乙酸部分而不是来自乙酰CoA的乙酰基。 酮戊二酸脱氢酶复合物催化的反应在化学上与丙酮酸脱氢酶复合物相似。 酮戊二酸脱氢酶复合物催化的一个高度放能的反应，反应产生的琥珀酸CoA像乙酰CoA一样，含有一个高能硫酯键。,（五）琥珀酰CoA转变成琥珀酸,琥珀酸CoA合成酶催化琥珀CoA裂解产生琥珀酸，并伴随高能磷酸化合物（GTP或ATP）的生成(见图)：这是柠檬酸循环中唯一直接产生高能磷酸化合物的反应，是底物水平磷酸化的又一个例子。由于其逆反应能形成硫酯键，因此，该酶也称为琥珀酸激酶。在哺乳动物体内，该反应通常合成的是GTP。植物和细菌的琥珀酸CoA合成酶则通常合成ATP。琥珀酰CoA合成酶催化的反应涉及到CoA被磷酸基取代，在该酶的活性部位形成琥珀酰基磷酸。然后，磷酸基转移到酶的活性部位的His残基上，形成磷酸组氨酸，并释放出琥珀酸；随后磷酸基被转移到GDP上，生成GTP（图118）。,底物水平磷酸化作用。,（六）琥珀酸脱氢形成延胡索酸,琥珀酸氧化转变成延胡索酸是在琥珀酸脱氢酶催化下进行的。FAD作为该酶的辅基，共价结合在酶的一个His残基上，在酶 促反应中接受底物氧化脱下的电子和氢（见图）。这一反应的自由能变化接近零。琥珀酸脱氢酶是柠檬酸循环中唯一的线粒体内膜结合蛋白，也 是琥珀酸CoQ氧化还原酶的一部分。琥珀酸 CoQ氧化还原 酶作为电子传递链复合物参与电子在线粒体内膜中的传递。柠檬酸循环的其他所有的酶都是可溶性的，位于线粒体基质中。琥珀酸的氧化涉及从它中间两个碳原子的相反两侧各除去一个H原子。这一涉及烷氧化成烯的反应没有足够的能量使NAD+还原，但却能使FAD还原为FADH2。,催化该反应的是琥珀酸脱氢酶。丙二酸是琥珀酸脱氢酶的强抑制剂。,（七）延胡索酸水合形成L苹果酸,延胡索酸在延胡索酸酶催化下，双键水合生成L苹果酸。水合反应很可能先形成碳负离子的转换态形式。转换态形成中，首先受到OH阴离子的攻击，形成负碳离子，接着发生质子（H）化反应（见图）：延胡索酸酶具有很高的立体专一性。它只作用于延胡索酸，从双键的相反方向加OH和H，生成L苹果酸，或者催化其逆反应，L苹果酸脱水变成延胡索酸。该酶不能催化顺丁烯二酸加水变成D苹果酸，也不能催化D苹果酸的脱水反应。,（八）L苹果酸脱氢形成草酰乙酸,苹果酸氧化转变成草酰乙酸是柠檬酸循环的最后一步反应。催化这一反应的酶是L苹果酸脱氢酶（见图）：该反应在热力学上不利于草酰乙酸的生成，而有利于逆向反应。因此，草酰乙酸在细胞内的浓度是很低的。但是，在细胞内，不利于草酰乙酸生成的反应可以被柠檬酸循环的第一步反应所推动，向有利于草酰乙酸生成的方向进行。因为柠檬酸合酶催化乙酰CoA与草酰乙酸的缩合反应是高度放能的。,三、柠檬酸循环总观,柠檬酸循环每循环一次，只有一分子的乙酰CoA被氧化，所有柠檬酸循环的中间物并不因此参加反应而有所增减。因此，柠檬酸循环可视为一种多步催化剂，能不断地氧化乙酰基。乙酰CoA进入柠檬酸循环后，有两处脱羧反应，有四处氧化脱氢反应，共生成三分子的NADH和一分子的FADH2；一次底物水平磷酸化，生成一分子的ATP。氧化反应生成的NADH和FADH2进入电子传递链，发生氧化磷酸化作用，生成ATP。所以柠檬酸循环与氧化磷酸化是协同进行的。同位素标记实验表明，乙酰CoA的乙酰基的碳并没有在柠檬酸循环的第一轮中除去。经脱羧反应生成两分子CO2的碳来自原有的草酰乙酸，而乙酰基的两个碳参与了草酰乙酸的重新合成。,四、柠檬酸循环的生物学意义,（一）提供能量在有氧条件下，一分子葡萄糖经过糖酵解和柠檬酸循环以及氧化磷酸化，总共可产生38分子或36分子的ATP，其中以柠檬酸循环产生的ATP最多。各阶段产生ATP的情况如表112所示。（二）柠檬酸循环也是其他有机物完全氧化的一条主要途径柠檬酸循环不仅是糖完全氧化的主要途径，也是其他化合物如脂肪酸、氨基酸等完全氧化的途径。（三）柠檬酸循环的双向功能虽然，柠檬酸循环是有机燃料分子氧化产生能量的主要途径，但是，该途径的中间物不仅起着维持循环运转的功能，而且一些重要的生物合成途径利用该循环的中间物作为合成反应的起始材料。因此，柠檬酸循环具有双向（合成和分解）的功能（图1110）。,第三节 柠檬酸循环的调节,柠檬酸循环的活性与细胞的需要密切相关。主要取决于两个方面的需要：细胞对能量的需要；细胞内的生物合成反应对代谢中间物的需要。为了保证中间物和能量的产生与细胞的需要相协调、避免能量和中间物的浪费性过度产生，柠檬酸循环必须有效地受到控制。丙酮酸的碳架进入柠檬酸循环被氧化的调节主要发生在两个环节上：即丙酮酸转变成乙酰CoA的控制和柠檬酸循环本身的活性控制。虽然由葡萄糖酵解产生的丙酮酸是柠檬酸循环的主要底物和中间物的来源，但乙酰CoA也可以从脂肪酸和氨基酸的氧化产生，因此，来自其他代谢途径的中间物的可用性对丙酮酸的氧化以及柠檬酸循环活性的调节也是重要的。,一、丙酮酸脱氢酶复合物活性的调节,丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA的反应是葡萄糖在有氧条件下进入柠檬酸循环的关键步骤。丙酮酸脱氢酶复合物活性的控制对于糖的有氧分解起着关键的作用。丙酮酸脱氢酶复合物的活性可受到两种不同的方式控制，即别构调节和共价修饰调节。,（一）别构调节,丙酮酸脱氢酶复合物的活性强烈受到高水平的ATP以及该酶复合物的产物乙酰CoA和NADH的抑制（图1112）。如果在长链脂肪酸存在下，这种抑制作用会明显加强。ATP能抑制丙酮酸脱氢酶的活性；乙酰CoA能抑制二氢硫辛酰转乙酰基酶的活性；NADH抑制二氢硫辛酰脱氢酶的活性。当AMP、 CoA和NAD处在高水平时，则激活丙酮酸脱氢酶复合物的活性。因此，丙酮酸脱氢酶复合物的活性强烈地取决于线粒体内的ATP / AMP、乙酰CoA / CoA以及NADH / NAD的比值。这样的比值高时，则会关闭该酶复合物的活性，降低丙酮酸进入柠檬酸循环被氧化的速度。当细胞需要能量时，其代谢信号是AMP / ATP以及NAD+ / NADH的水平高，该酶复合物被激活，导致丙酮酸进入柠檬酸循环的速度升高。,（二）共价修饰调节,在脊椎动物中，丙酮酸脱氢酶复合物共价修饰调节是对该酶复合物别构调节的重要补充。两种辅助性的酶与丙酮酸脱氢酶复合物结合在一起，它们对丙酮酸脱氢酶复合物的活性的共价修饰调节起很重要的作用。一种是丙酮酸脱氢酶激酶，另一种是丙酮酸脱氢酶磷酸酶。当细胞含有较高水平的ATP、并含有丰富的乙酰CoA时，便构成了一种信号，表示乙酰CoA不需要再继续合成。在这种情况下，ATP以及乙酰CoA和NADH作为丙酮酸脱氢酶激酶的激活剂刺激它的活性。激活后的这个激酶能利用ATP使丙酮酸脱氢酶特定部位上的丝氨酸残基磷酸化而失去活性（图1113）。,当细胞需要能量（即ATP水平降低时），无活性的磷酸化的丙酮酸脱氢酶便在丙酮酸脱氢酶磷酸酶的催化下，脱去磷酸基而恢复其活性。这个磷酸酶的活性受Ca2+浓度调节。当游离的Ca2+浓度升高时，这个酶便可以被激活。而游离的Ca2+ 浓度的变化取决于细胞对ATP的需要，当细胞需要产生ATP时，浓度也就随之升高。因此，游离的 Ca2+ 浓度的变化可以作为代谢变化的一种重要的信息。当血糖浓度升高时，胰岛素的分泌受到刺激，胰岛素也能激活丙酮酸脱氢酶磷酸酶的活性。促进乙酰CoA的合成。在植物线粒体内，丙酮酸脱氢酶也受磷酸化和去磷酸化的调节。在大肠杆菌细胞内的该酶不经这种共价修饰调节。丙酮酸脱氢酶的活性不受cAMP的影响。,二、柠檬酸循环的活性控制,根据柠檬酸循环的8个步骤的G和G的变化（表113）可以看出，柠檬酸合酶、异柠檬酸脱氢酶以及酮戊二酸脱氢酶复合物催化的反应远未达到平衡，即这三种酶催化的反应是高度放能的，也是不可逆的。因此，这三种酶催化柠檬酸循环的限速反应步骤。在心肌中，柠檬酸循环是活跃的，代谢物通过该循环的流量是与细胞呼吸的速度成正比的。柠檬酸循环的第一步反应是由柠檬酸合酶催化，对柠檬酸合酶活性的控制也许是柠檬酸循环最关键的控制部位。,顺乌头酸酶催化的反应接近平衡，因此，柠檬酸消耗的速度取决于异柠檬酸脱氢酶的活性。ATP可视为柠檬酸循环和氧化磷酸化的末端产物，它可以别构抑制柠檬酸合酶和异柠檬酸脱氢酶的活性，而ADP则是这两种酶的别构激活剂。Ca2+是脊椎动物肌肉收缩的信号，它伴随对ATP的需要而增高它的浓度。 Ca2+可以作为一种效应物激活异柠檬酸脱氢酶和酮戊二酸脱氢酶复合物的活性。,四、柠檬酸循环的化学总结算,柠檬酸循环的每一次循环都纳入一个乙酰CoA分子。又有两个碳原子以CO2的形式离开循环。每一次循环共有4次氧化反应。参加这4次氧化反应的有3个NAD分子和一个FAD分子，同时有4对氢原子离开循环，形成3个NADH和一个FADH2分子。每一次循环以GTP的形式产生一个高能磷酸键，并消耗两个水分子。,五、柠檬酸循环的调控,柠檬酸循环可概括地看作来自两个方面地调控：柠檬酸循环本身所具有的内部相互制约系统的调节。 ADP、