第六章 动植物细胞培养反应器

第六章 动、植物细胞培养反应器,第一节 植物细胞（组织）培养反应器,地球上75%的人口以植物作为治病、防病的药物来源。但是由于人类对天然植物药资源的掠夺性开发，使得天然资源已经枯竭。80年代末期植物细胞培养技术的兴起为缓和矛盾、生产更多的有用代谢产物提供了方法和机会，开辟了植物资源合理利用的新途径。,一、植物培养过程的特点       虽然微生物培养中的许多技术可用于植物细胞培养，但由于植物细胞本身固有的特性，要建立一套适合于植物细胞培养的技术和装置，必须要了解植物细胞的有关性质。  1、植物细胞形态       植物细胞要比微生物细胞大得多，在培养过程中，细胞形态及大小有明显的变化，并会有聚集成块的情况出现。在生长停止后，细胞形态随之变化并出现块状细胞游离分散的现象。,2、植物细胞培养液的粘度和微生物发酵液表现出明显的不同，一般属于非牛顿型流体。培养过程中粘度变化相当之大。  3、植物细胞培养的需氧量要比微生物发酵的需氧量低得多。过高的氧传递效率，会导致细胞浓度的降低。在k La值高的操作条件下，通入一定量的CO2对细胞量的增大是有效的。  4、植物细胞对剪切力比微生物细胞敏感。,二、植物细胞培养反应器       植物细胞培养主要采用悬浮培养和固定化细胞培养系统。       悬浮培养所用生物反应器主要有机械搅拌反应器和非机械搅拌反应器。       固定化细胞培养反应器有填充床反应器、流化床反应器和膜反应器等类型。1、悬浮培养生物反应器（1）机械搅拌式反应器,机械搅拌式反应器采用机械搅拌器使溶质均匀混合，其主要优点是能获得较高的kLa值。而其存在的主要问题是植物细胞的细胞壁对剪切的耐受力差。       单就剪切对细胞造成伤害、抑制植物细胞生长和次级代谢物合成而言，对搅拌器加以改进，可以减少搅拌过程中的剪切力，从而使搅拌式反应器能更广泛地用于植物细胞培养。       另外，通过对细胞在搅拌式反应器上的长期驯化，细胞对剪切力的耐受程度也大大提高。,由于机械搅拌反应器单位体积消耗的功率较高，反应器的搅拌轴也给无菌密封带来困难，反应器内的搅拌装置也给器内增加了死角，尽管机械搅拌反应器已成功用于植物细胞培养，但如何更好地应用于次级代谢产物的生产还需更深入的研究。（2）非机械搅拌式反应器       通常为气体搅拌式反应器，是一种利用通入的空气来搅拌的反应器，主要有鼓泡式和 气升式（外循环和内循环）,植物细胞培养属于低、中需氧系统，气体搅拌通常比机械搅拌更为有效。气体搅拌反应器因没有搅拌装置而易保持无菌。也因其结构简单、传氧效率高以及剪切力低而更适合植物细胞培养。       因搅拌强度低，使培养物混合不均，必须依靠大量通气输入动量和能量，以保证反应器内培养液的良好传质、传热。过量的通气，也易于驱除培养液中的CO2和乙烯，对细胞生长反而有阻碍作用；过高的溶氧也对植物细胞合成次级代谢产物不利。,2、固定化细胞生物反应器固定化细胞培养可以在一定程度上防止培养过程中高产细胞系出现低产率和生成其他代谢物的情况发生；固定化细胞包埋在支持物内，可以消除或极大地减弱流质流动引起的切变力；细胞在一定限定范围内生长也可以导致一定程度的分化发育，从而促进次级代谢产物的产生；便于进行连续化操作；,固定化细胞反应器的类型：（1）填充床反应器       细胞固定于支持物表面或内部，支持物颗粒堆叠成床，培养基在床层间流动。       填充床中单位体积细胞较多，由于混合效果不好常使床内氧的传递、气体的排除、温度和pH控制困难。如支持物颗粒破碎还易堵塞填充床。,（2）流化床反应器       利用流体的能量使支持物颗粒处于悬浮状态。       该反应器混合效果较好，但流体的切变力和固定化细胞的碰撞常使支持物颗粒破损。另外，流体动力学复杂使其放大困难。（3）膜反应器       采用具有一定孔径和选择性的膜固定植物细胞。营养物质可以通过膜渗透到细胞中，细胞产生的次级代谢产物通过膜释放到培养液中。,膜反应器主要有中空纤维反应器和螺旋卷绕反应器。    在中空纤维反应器中，细胞保留在装有中空纤维的管中。螺旋卷绕反应器是将固定有细胞的膜卷绕成圆柱状。    与海藻酸盐凝胶固定化相比，膜反应器的操作压较低，流体动力学易于控制，易于放大，而且能提供更均匀的环境条件，同时还可以及时地进行产物分离以解除产物的反馈抑制，但构建膜反应器的成本较高。,3、植物细胞培养反应器的放大       一般认为，植物细胞培养反应器的放大过程可以以相同体积氧传递系数为依据。同时考虑合理的搅拌强度。整个反应器放大过程需要在充分了解大型反应器内流体流动、传热、传质规律上进行。三、植物组织培养反应器       研究表明，植物次级代谢产物的合成常与植物细胞的分化程度有关。因此，可利用高度分化的植物器官、组织来培养以提高目的产物含量。,在组织培养研究中，大规模培养系统发展较为突出的领域主要有以下几种： 1、发状根大规模培养       由发根脓杆菌感染双子叶植物形成的发状根具有生长迅速，遗传性稳定和生化特性不易改变以及易于进行遗传操作的特点。这一培养系统成为继细胞培养后又一新的培养系统，它对传统药材来说极为重要，因为约三分之一的传统药材来源于植物的根部。,发状根大规模培养技术的主要问题是传质，这是因为培养对象是相互连结的非均匀物质，因此流体动力学性质明显不同于悬浮培养细胞。       目前，非搅拌式反应器和固定化反应器已用于发状根大规模培养。也有报道，通过设置适当装置阻隔发状根与搅拌桨叶，可以利用机械搅拌式反应器来进行发状根大规模培养。,2、小植物的大规模快速繁殖       通过大规模悬浮培养技术进行植物的快速繁殖与传统的快速繁殖技术相比具有培养容积小，劳动强度小、费用低廉的特点，它是继试管繁殖后又一十分有用的培养技术。       采用组织培养来进行植物的快速繁殖有两条途径：从植株茎尖诱导不定芽后在反应器中大规模培养不定芽或不定根；从植株外植体诱导胚性愈伤组织进而得到体胚，然后在反应器中大规模培养体胚，最终制成人工种子。,植物快速繁殖用的反应器有两类：机械搅拌反应器：旋转鼓式、旋转过滤器式、空气吹动式。非机械搅拌式反应器：气升式、气泡柱式、氧透膜通气式、交叉通气式。       此外，还有浅层循环式、双层板径向流生物反应器、内环喷雾生物反应器等。,第二节 动物细胞培养反应器,依靠基因工程技术、杂交瘤技术、细胞工程技术的动物细胞体外培养具有明显的表达产物方面的优点，为传统的微生物发酵技术所无法替代，其中以它们转录后修饰和产物胞外分泌表达最为人们所感兴趣。同时，许多外源蛋白基因可转入动物细胞中并能大量扩增，使得动物细胞能够高质量地表达有价值的蛋白。由此，可生产出与人类健康和生存密切相关的大量的生物制品。,一、动物细胞培养方法       体外培养的动物细胞有两种类型：非贴壁依赖性细胞：来源于血液、淋巴组织的细胞，肿瘤细胞（杂交瘤细胞），转化细胞。可采用培养微生物的方法进行悬浮培养；贴壁依赖性细胞：大多数动物细胞，包括非淋巴细胞和许多异倍体细胞。需要附着于带适量正电荷的固体或半固体表面上生长；,动物细胞培养方法有以下几种：  1、贴壁培养  用于贴壁依赖性细胞       最初采用滚瓶系统培养，但劳动强度大，单位体积提供细胞生长的表面积小，占用空间大，控制困难。       目前，采用微载体系统培养。细胞贴附于微载体上，悬浮于培养基中，逐渐生长成单层。,微载体培养技术将单层培养和悬浮培养融会在一起，具有两者的优点：   （1）表面积/体积比大，单位体积培养基细胞产率大；   （2）微载体悬浮于培养基中，细胞生长环境均一，环境因素的监控容易；   （3）培养基利用率高；   （4）采样重演性好，放大容易；   （5）收获过程不复杂；   （6）劳动强度小，占用空间小；,2、悬浮培养       用于非贴壁依赖性细胞的培养，可借鉴微生物发酵的部分经验，但又有其自身的特点。小规模培养多采用转瓶或滚瓶培养，大规模采用发酵罐式的细胞培养反应器。  3、固定化培养       既可用于非贴壁依赖性细胞，也可用于贴壁依赖性细胞。采用固定化培养，细胞生长密度高，抗剪切力和抗污染能力强。非贴壁依赖性细胞常用海藻酸钙包埋，贴壁依赖性细胞常用胶原包埋。,二、细胞培养的操作方式   1、分批式操作   2、流加式操作   3、半连续式操作       又称为反复分批式培养或换液培养，是指在分批式操作的基础上，不全部取出反应系，剩余部分补充新的营养成分，再按分批式操作。  4、连续操作,5、灌注培养       细胞接种后，一方面新鲜培养基不断加入反应器，一方面又将反应液不断的取出，但细胞留在反应器内，使细胞处于一种不断的营养状态。可进行细胞的高密度培养。       灌注培养不仅可以大大提高细胞生长密度，而且有助于产物的表达和纯化。,三、动物细胞大规模培养反应器   1、通气搅拌式细胞培养反应器       各种搅拌细胞培养反应器的主要区别是搅拌器的结构，要求搅拌器转动时产生的剪切力小，混合性能好。       其中由NBS开发的笼式通气搅拌器能符合以上的要求。这种搅拌器分别包括笼式的通气腔和消泡腔。       气液交换在由200目不锈钢丝网制成的通气腔内实现。,产生的气泡进到液面上部的由200目不锈钢丝网制成的消泡腔内破碎成气、液两部分，达到深层通气而不产生泡沫的目的。       搅拌器转速保持在30-60rpm不变。培养基和细胞通过3个导流筒在搅拌器中心管和搅拌器外反复循环，反应器内流体混合相当好。       但其缺点是：氧传递系数小，不能满足高密度细胞培养的耗氧要求；气路系统不能单独原位灭菌，难于放大。,华东化工学院将单层笼式通气搅拌器改为双层笼式通气搅拌器，以扩大丝网交换面积，提高氧传递系数，用于动物细胞培养效果明显。  2、气升式动物细胞培养反应器       和搅拌式生物反应器相比，气升式反应器中产生的湍动温和而均匀，剪切力相当的小；同时反应器内无机械运动部件，因而细胞损伤率比较低；反应器内直接喷射空气供氧，氧传递速率高；反应器内液体循环量大，细胞和营养成分能均匀的分布在培养基中。,英国Celltech公司首先采用气升式全自动培养系统培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。       混合气体自培养器底部管道输入，气体沿着培养器中央的内管上升。一部分气体从培养器顶部逸出，另一部分气体被引导沿培养器的内缘下降，直达培养器底部和新吹入的气体混合而再度上升。借助气体的不断循环搅动培养器内的细胞，使之不贴壁。其优点是：没有运动部件；完全密封；便于无菌操作；放大容易；不易污染；氧的转换率高；,3、中空纤维细胞培养反应器       中空纤维细胞培养反应器即可培养悬浮细胞，也可培养贴壁依赖性细胞，细胞密度可高达109/ml数量级。       中空纤维是用聚矾或丙烯的聚合物制成。直径200m。管壁是半透膜，能截留一定分子量的物质。一个培养筒内由数千根中空纤维所组成，封存在特制的圆筒里。在圆筒里形成两个空间：纤维管内成为“内室”，可灌流无血清培养液;管与管之间的间隙形成外室。,接种的细胞就贴附在外室的管壁上，并吸取从内室渗透的养分。而培养液中的血清和细胞分泌产物属大分子，无法穿透到内室，只能在外室被浓缩，直到排出。细胞分泌的代谢废物属小分子可以从管壁渗透到内室，由内室出口排出，不会对细胞产生毒害。,4、微囊培养技术       在无菌条件下，将活细胞或活性物质悬浮在1.4%海藻酸钠溶液中，通过特制的成滴器，滴入氯化钙溶液中，形成含活细胞的凝胶小珠。再用多聚赖氨酸包被，形成坚韧多孔可通透的外膜。重新液化凝胶小珠，使成胶物质流出多孔外膜，而活细胞或生物活性物质留在多孔膜内。放入气升式培养系统进行增殖。,微囊内的活细胞由于有半透膜，可以防止污染和物理损伤。小分子的营养物质、氧、代谢产物可以自由进出外膜。而大分子的产物在微囊内积累。       微囊培养系统具有几个特点：细胞密度大；产物单位体积浓度高；分离纯化操作经济简便；抗体活性、纯度好；,5、大载体系统       将细胞悬液注入无菌低粘度的海藻酸钠溶液中混均，通过喷珠装置喷入无菌的氯化钙溶液中，制得直径2.6mm携带细胞的大载体，再进行气升式悬浮培养。       该系统的特点是：操作控制方便，可随机取样检测；附着细胞密度高；消耗用品价格低廉，产物收获量大，有明显经济效益。,6、微载体培养系统        利用固体小颗粒作为载体，细胞在载体的表面附着，通过连续搅拌悬浮于培养液中，并形成单层生长、繁殖。       特点是：具有较高的表面积/体积比；生长环境均一，条件易于控制，放大容易；兼具贴壁培养和悬浮培养的优势；培养液和细胞分离容易；大规模培养只需对微生物搅拌式或气升式培养系统稍加改进即可；可以为不能进行悬浮培养的细胞转向悬浮培养和大量繁殖提供有效的手段。,目前，开发的微载体有液体微载体、大孔明胶微载体、甲壳质微载体、聚尿烷泡沫微载体、磁性微载体等。,第三节 微藻培养反应器,当今，大规模养殖的微藻有：螺旋藻、小球藻和杜氏藻。       微藻培养具有以下优点：光能利用率高；生物量易于收获、加工和利用；可生产特别高浓度的、有商品化价值的产物；生产周期短，繁殖快，遗传选择和藻株筛选快而容易；,一、微藻大规模培养的特点    1、微藻培养过程要有足够的光照；    2、微藻培养过程必须供应大量的CO2，同时要将产生的大量氧气从液体中排出；    3、混合过程除要满足气液传递、固液传递、防止细胞沉降外，还要保证细胞在垂直方向上的混合，保证受光充分；    4、培养液用海水配置，并注意海水对反应器的腐蚀作用；,二、微藻大规模培养反应器       微藻大规模培养反应器有两类：敞开式培养反应器、封闭式光生物反应器   1、敞开式培养反应器      一般在敞开的水平浅池中进行，或利用天然湖泊、环湖礁等。池深10-30cm，采用聚乙烯或水泥砌衬，面积可达几千平方米。池内采用桨板轮、螺旋桨或空气喷射器进行搅拌，或将池体隔成跑道，用泵使藻液循环。,目前，敞开式跑道池培养系统最常用，但由于敞开式培养反应器缺点太多，应用上不如封闭式光培养反应器。 2、封闭式光培养反应器     封闭式光培养反应器具有以下优点： 培养效率高，藻体的采收十分方便； 培养条件易于控制，并实现自动控制； 污染少，易于实现纯种培养； 生产周期延长，甚至可以终年生产； 适合于所有的藻类，尤其是藻类代谢物的   生产；,在进行封闭式光培养反应器设计时，应依照以下原则：高的光照表面积与体积之比；较高的气体交换率；合适的循环方式；改善光的传播途径、分配和质量；防止有害次生代谢产物的积累；易于实现培养条件的最优控制；降低成本；,（1）管道式光培养反应器       反应器的主体是一条由透明塑料制成的管子，排列成不同的形式以便充分的利用太阳光。含有藻类的培养液通过泵或空气升液器的作用在管道中循环流动。CO2随培养液一起流动，与培养液接触时间长，因而利用率高。     &nbs