BioXL禽流感病毒H1- H15通用型PCR检测试剂盒说明书

BioXL 禽流感病毒 H1- H15 通用型 PCR 检测试剂盒说明书【试剂盒组成】25 管 扩增反应试剂球 (Reagent Sphere; 4 保存)2 x 520 l AIV 扩增反应试剂球溶液 (Sphere Diluent; -20 保存)2 x 25 l 阳性对照 (Positive control; -20 保存)【保存条件】试剂球需置干燥剂中保存在4，已融解的试剂球则需保存在零下20。其他试剂亦需保存在零下20。使用前在冰上溶解各试剂并充分混合，不要旋涡振荡含酶的扩增反应试剂。【操作程序】1 样本采集、存放及运输1.1 样本采集：所用取样器材必须经高压或干热灭菌。若样品为活禽，建议取咽喉拭子和泄殖腔拭子：取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上颚裂来回刮几次取咽喉分泌液，取泄殖腔拭子时将拭子深入泻殖腔转一圈沾取粪便。然后将拭子一起放入盛有2ml PBS（含抗菌素）的试管，充分洗涤拭子，然后在管壁挤干液体，转入无菌离心管中备用。若样品为新鲜肌肉或脏器，取待检样品2g 于已洗净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加10ml PBS 混匀，取上清转入无菌离心管中备用。为使样品的代表性更强，也可取50克肉样，加入50ml 无菌的 PBS 液，用 Bagmixer 均质器处理后，取上清备用。若样品为血清、血浆或冷冻组织渗出液，则直接取用。1.2 存放：分离后的样本在2 8条件下保存应不超过24hr； -70以下可长期保存，但应避免反复冻融（最多冻融3次） 。1.3 运输：采用冰壶或泡沫箱加冰密封进行运输。2 样本处理：2.1 取 n 个1.5ml 灭菌离心管（n = 样本数+ 1管阴性对照+ 1管阳性对照） ，作好标记。2.2 首先加入 600ul 裂解液（裂解液即提取液，有很强的腐蚀性，切勿沾到皮肤或衣物，否则立即用大量清水冲洗并擦干） ，然后分别加入待测样本、阴性对照、阳性对照各200ul（一份样本换用一个吸头） ；再加入200ul 氯仿，混匀器上振荡混匀5sec（不宜过于强烈，以免产生乳化层，也可用手颠倒混匀） 。2.3 于12,000g 离心15min（如有条件，于4进行离心） 。2.4 取与步骤2.1.1中相同数量的1.5ml 灭菌离心管，加入400ul 异丙醇（20预冷） ，作好标记。吸取步骤2.1.3各管中的上清液相转移至相应的管中（上清液应至少吸取500ul，注意不要吸出中间层，该层富含 DNA 和蛋白质） ，颠倒混匀。2.5 12,000g 离心15min， （注意固定离心管方向，即将离心管开口朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地方沾干） ；加入600ul 75%乙醇（20预冷） ，颠倒洗涤。2.6 12,000g 离心10min， （注意固定离心管方向，即将离心管开口朝离心机转轴方向放置）。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体（不同样品应在吸水纸不同地方沾干） 。2.7 4,000g 离心 10sec（注意固定离心管方向，即将离心管开口朝离心机转轴方向放置）将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干（一份样本换用一个吸头，注意吸头不要碰到有沉淀一面） ，室温干燥5-10min（不宜过于干燥，以免 RNA 不溶） 。2.8 加入 11ul DEPC 水，轻轻混匀，溶解管壁上的 RNA，2,000g 离心5sec，冰上保存备用（注意：此时的 RNA 最易受 RNA 酶降解，请在2小时内进行 PCR 扩增） 。3 扩增反应试剂的准备：3.1 计算所需的反应数量 (n)3.2 需要溶解的试剂球 = 0.5 x n3.3 每个试剂球需要 40 l 试剂球溶液3.4 在冰上溶解试剂，并轻轻扣击充分混合 (不要旋涡振荡含酶的试剂)4 反应的准备4.1 实验中除从样本中获得的 RNA 模板外，我们还建议设置阳性和阴性（水）对照4.2 按照下表准备扩增反应试剂：反应组分-每个反应体积扩增反应试剂 20 l样品 RNA 5 l总体积 25 l注意:实验时 RNA 应放在冰上，阳性对照建议加5 l 试剂盒提供的阳性对照。建议 PCR 过程中检测样本设置重复，以便得到可靠的实验结果。为了验证阴性实验结果不是由于样本中存有 PCR 抑制物而导致 PCR 呈阴性反应，我们建议在测试样本中加1 l 的阳性对照作为 spiking 对照(spiking control)，同时进行 PCR 反应。PCR 循环:1 个循环 42 30 分钟95 10 分钟40 个循环 95 30 秒53 30 秒72 30 秒5 实验数据分析PCR 的产物需要通过琼脂糖凝胶电泳检测。产物长度 : 246 bpSpiking 对照阴性的实验结果有几个可能性： 样本中不存在目的片段；样本中目的片段的量低于检测值；【样本中存有 PCR 抑制物】试剂盒中设计 spiking 对照 (spiking control) 是为了确定没有发生 PCR 抑制。如果样本中加了阳性对照以后得出阴性结果，说明样本中存在 PCR 抑制物，那幺此次阴性的实验结果就不能作为正确的结果，需要重新开始样本核酸的提取和 PCR 扩增。备注：对于禽流感检测样本的获得和前处理，可以参照国家标准“高致病性禽流感诊断技术（GB/T 18936-2003） ”推荐的方法进行，具体为：【病料的采集】死禽采集气管、脾、肺、肝、肾和脑等组织样品，进行分别处理或者同时处理；活禽病料应包括气管或泄殖腔拭子，尤其以采集气管拭子更好；小珍禽用拭子取样易造成损伤，可采集新鲜新鲜粪便。【病料的保存】病料应放在含有抗菌素的 pH 值7.07.4的等渗磷酸盐缓冲液（PBS）内（无 PBS 可用2550的甘油盐水） 。抗生素的选择视当地情况而定，组织和气管拭子悬液中应含有青霉素（2000IU/ml） 、链霉素（2mg/ml） 、庆大霉素（50g/ml）和制霉菌素（1000IU/ml） ，但粪便和泄殖腔拭子所有的抗生素浓度应提高5倍，加入抗生素后 pH 值应调至7.07.4。在室温放置1h2h 后样品应尽快处理，没有条件的可在4存放几天，也可于低温条件下保存（-70贮存最好） 。【病料的处理】将棉拭子充分捻动、拧干后弃去拭子；粪便、研碎的组织用含抗生素的 pH值7.07.4的等渗 PBS 溶液配成1020（g/ml）的悬液，样品液经1000r/min 离心10min，取上清液作为实验材料。【病料保存样本保存和运送的一般原则是什么】一般性原则：采集和运输：标本采集用材料，如棉签和拭子都应一次性使用，所使用的抗腐剂和抗凝剂不应对样本和扩增反应有降解或抑制作用。对于 RNA 样本，要特别注意混入操作人员的毛发、表皮细胞和痰液。对于 DNA 样本的运送：可在室温下运送，建议在8小时内完成，对 RNA，10分钟内的运输可在室温进行，超过此时间，必须加冰运输，既便低温，一般亦不得超过4小时。标本的保存：对 DNA：28可稳定放置3天，RNA 一律20保存。主要的扩增反应抑制物质：血样中用于抗凝的肝素，可以枸橼酸