抗体综述PPT课件.ppt

第四章抗体和免疫球蛋白 免疫球蛋白 Immunoglobulin Ig 是指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白 首先什么是免疫球蛋白 1 抗体 antibody Ab 第一节抗体的概念与分类 抗原刺激机体免疫系统中的B细胞增殖分化为浆细胞后所产生的一种糖蛋白 主要存在于血清等体液中 能与相应抗原特异性地结合 具有免疫功能 2 抗体与免疫球蛋白是不同的概念 抗体是免疫球蛋白 但免疫球蛋白不全是抗体 血清蛋白根据电泳可分为 白蛋白 球蛋白 抗体分布在 球蛋白的区域 但主要分布在 球蛋白区域 抗体是与抗原对应的名称着重于特异性生物活性 不着重于化学本质 免疫球蛋白是指具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白并不明确对具体抗原的特异性 着重于化学含义 3 4 抗体的分类 一 根据所对应的抗原分 1 异种抗体 heteroantibody2 同种抗体 alloantibody3 自身抗体 autoantibody4 异嗜抗体 heterophileantibody 5 一 根据所对应的抗原分 1 异种抗体 2 同种抗体 3 自身抗体 4 异嗜抗体 6 抗体的分类 一 根据所对应的抗原分 1 异种抗体 2 同种抗体 3 自身抗体 4 异嗜抗体 同一种属的两个或两个不同近交系动物之间免疫所产生的抗体 如 7 抗体的分类 一 根据所对应的抗原分 1 异种抗体 2 同种抗体 3 自身抗体 4 异嗜抗体 8 抗体的分类 一 根据所对应的抗原分 1 异种抗体 2 同种抗体 3 自身抗体 4 异嗜抗体 不同种属的动物 植物和微生物之间存在的的共同抗原称为异嗜性抗原或Forssman抗原 由异嗜性抗原所引起的抗体称为异嗜抗体 9 二 根据有无抗原刺激分 1 天然抗体 Naturalantibody2 免疫抗体 Immuneantibody 10 二 根据有无抗原刺激分 1 天然抗体 2 免疫抗体 也称为正常抗体 Normalantibody 是在没有人工免疫和感染的条件下 没有明显的特异性抗原刺激即天然存在于体液中的抗体 如 A型人血清中的抗B抗体B型人血清中的抗A抗体 11 抗体的分类 二 根据有无抗原刺激分 1 天然抗体 2 免疫抗体 感染或预防接种后所产生的抗体 12 三 根据与抗原反应的性质分 1 完全抗体 Completeantibody2 不完全抗体 Incompleteantibody 13 抗体的分类 三 根据与抗原反应的性质分 1 完全抗体 2 不完全抗体 即二价或多价抗体免疫球蛋白的单体有两个抗原结合位点 所以是二价的 完全抗体至少是二价的 它与抗原结合后可在特定条件下出现可见反应 14 抗体的分类 三 根据与抗原反应的性质分 1 完全抗体 2 不完全抗体 即单价抗体或封闭抗体如IgG的两个抗原结合位点之一失去结合抗原的活性 只剩下一个与抗原结合的位点 与抗原不能形成的抗原抗体复合物 不出现可见反应 但能封闭和遮断抗原与完全抗体结合 15 四 根据抗原性分 1 IgA 2 IgD 3 IgE 4 IgG 5 IgM 主要的根据重链的不同 详细内容我们将在抗体结构中介绍 16 第二节免疫球蛋白的结构 Porter等对血清IgG抗体的研究证明 Ig分子的基本结构是由四肽链组成的 即 由二条相同的分子量较小的肽链 轻链 和二条相同的分子量较大的肽链 重链 组成 17 轻链与重链是由二硫键连接形成一个四肽链分子称为Ig分子的单体 一 单体 单体是构成所有免疫球蛋白分子的基本结构 18 所有Ig的单体都是四条肽链的对称结构 即 两条糖基化重链 H 和两条非糖基化轻链 L 每条重链和轻链分为氨基端 N端 和羧基端 C端 二 单体结构 19 20 一 轻链和重链 1 轻链 lightchain L 大约214个氨基酸残基 分子量约24kD 通常不含碳水化合物 每条轻链含有两个由链内二硫键所组成的环肽 L链共有两型 kappa 与lambda 同一个天然Ig分子上L链的型总是相同的 正常人血清中的 约为2 1 21 约为轻链的2倍 含450 550个氨基酸残基 分子量约为55或75kD 每条H链含有4 5个链内二硫键所组成的环肽 2 重链 heavychain H链 22 4 根据H链抗原性的差异可将其分为5类 不同H链与L链 或 链 组成完整Ig的分子分别称为IgM IgG IgA IgD和IgE 23 24 二 可变区和恒定区 通过对H链或L链的氨基酸序列比较分析 发现其N 末端序列变化很大 称此区为可变区 V 而C 末端氨基酸则相对稳定 变化很小 称此区为恒定区 C区 25 位于L链靠近N端的1 2 约含108 111个氨基酸残基 和H链靠近N端的1 5或1 4 约含118个氨基酸残基 1 可变区 variableregion V区 每个V区中均有一个由链内二硫键连接形成的肽环 每个肽环约含67 75个氨基酸残基 26 L链和H链的V区分别称为VL和VH V区氨基酸的组成和排列的变异很大 由于V区中氨基酸的种类为排列顺序千变万化 故可形成许多种具有不同结合抗原特异性的抗体 27 在VL和VH中某些局部区域的氨基酸组成和排列顺序具有更高的变化程度 这些区域称为高变区 hypervariableregion HVR 在V区中非HVR部位的氨基酸组面和排列相对比较保守 称为骨架区 frameworkregion 研究证明 高变区是抗体与抗原结合的位置 故称为决定簇互补区 complementaritydeterminingregion CDR 28 位于L链靠近C端的1 2 约含105个氨基酸残基 和H链靠近C端的3 4或4 5区域 约从119位氨基酸至C末端 2 恒定区 constantregion C区 同一种属动物中 同一类别Ig分子C区氨基酸的组成和排列顺序相对恒定 具有相同的抗原性 29 Ig分子的H链与L链可通过链内二硫键折叠成若干球形功能区 每一功能区约由110个氨基酸组成 在功能区中氨基酸序列具有高度同源性 三 功能区 30 1 L链功能区分为两区 L链可变区 VL L链恒定区 CL 31 2 H链功能区 IgG IgA和IgD的H链有4个功能区 1个可变区 VH 3个恒定区 CH1 CH2和CH3 32 IgM和IgE的H链有5个功能区1个可变区 VH 4个恒定区 CH1 CH2 CH3和CH4 33 VH和VL是结合抗原的部位 CH和CL上具有部分同种异型的遗传标志 3 功能区的作用 IgG的CH2和IgM的CH3具有补体C1q结合位点 可启动补体活化经典途径 IgG借助CH2部分可通过胎盘 IgG的CH3可结合各种细胞表面的FcR IgE的CH2和CH3可与肥大细胞和嗜碱性粒细胞的IgEFc受体结合 34 铰链区不是一个独立的功能区 位于CH1与CH2之间 包括H链间二硫键 该区富含脯氨酸 不形成 螺旋 四 铰链区hingeregion 35 当抗体与抗原结合时 铰链区发生扭曲 使抗体分子的2个抗原结合点更好地与2个抗原决定簇发生互补 由于CH2和CH3构型变化 显示出活化补体 结合组织细胞等生物学活性 36 三 J链和分泌成分 J链 joiningchain 存在于二聚体分泌型IgA和五聚体IgM中 酸性糖蛋白 分子量约15kD 含有8个半胱氨酸残基 以二硫键连接到 链或 链的羧基端的半胱氨酸 3 可能对Ig二聚体 五聚体或多聚体的组成及在体内转运具有一定的作用 37 是分泌型IgA上的一个辅助成分 分子量约为75kD 糖蛋白 由上皮细胞合成 以共价形式结合到IgA分子 并一起被分泌到粘膜表面 分泌成分 secretorycomponent SC SC的存在对于抵抗外分泌液中的蛋白水解酶的降解具有重要作用 又称分泌片 secretorypiece SP 38 四 单体 双体和五聚体 单体由一对L链和一对H链组成的基本结构 如IgG IgD IgE 血清型IgA 39 由J链连接的两个单体如 分泌型IgA secretoryIgA SIgA SIgA结合抗原的亲合力比单体IgA高 2 双体 40 由J链和二硫键连接五个单体 如IgM 在J链存在下 组成五聚体 3 五聚体 41 分泌型IgA和IgM产生示意图 42 五 免疫球蛋白的酶水解片段 43 1 木瓜蛋白酶的水解片段 Porter等最早用木瓜蛋白酶 papain 水解兔IgG 从而获知了Ig四肽链的基本结构和功能 裂解部位 IgG铰链区H链链间二硫键近N端侧切断 裂解片段 共裂解为3个片段 44 每个Fab段由1条完整的L链和1条约为1 2的H链组成分子量为54kD Fab段可结合抗原 但表现为单价 不能形成凝集或沉淀反应 Fab中约1 2H链部分称为Fd段 约含225个氨基酸残基 包括VH CH1和部分铰链区 2个Fab段 抗原结合段 fragmentofantigenbinding 45 由两条约1 2的H链所组成 分子量约50kD Ig在异种间免疫所具有的抗原性主要存在于Fc段 1个Fc段 可结晶段 fragmentcrystallizable 46 2 胃蛋白酶的水解片段 Nisonoff等最早用胃蛋白酶 pepsin 裂解免疫球蛋白 裂解部位 铰链区H链链间二硫键近C端切断 47 裂解片段 F ab 2 包括VH VH1和铰链区 F ab 2具有双价抗体活性 与抗原结合可发生凝集和沉淀反应 但不具备固定补体以及与细胞膜表面Fc受体结合的功能 Fc 可继续被胃蛋白酶水解成更小的片段 pFc 失去其生物学活性 48 49 第三节免疫球蛋白的特性与功能 免疫球蛋白的抗原性抗体的功能五类免疫球蛋白的特性 50 一 免疫球蛋白的抗原性 Ig本身是蛋白质 具有抗原性 将Ig作为抗原免疫异种动物 同种异体甚至自身可引起不同程度的免疫反应 根据Ig抗原决定簇存在的不同部位以及在异种 同种异体或自体中产生免疫反应的差别 可把Ig的抗原性分为3种不同抗原决定簇 同种型同种异型独特型 51 一 同种型 isotype 指同一种属内所有个体共有的Ig抗原特异性的表位 在异种体内可诱导产生相应的抗体 换句话说 同种型抗原特异性因种属而异 同种型的抗原性位于CH和CL 同种型主要包括Ig的 类和亚类 型和亚型 52 1 类和亚类 classesandsubclasses 类 存在于H链的恒定区 CH 根据CH抗原性的差异 即氨基酸组成 排列 构型 二硫键等不同 H链可分为 和 五类 因此 Ig的分为IgM IgG IgA IgD和IgE五类 在基因水平上 不同类的H链恒定区的是由不同的恒定区基因片段所编码 不同类Ig在理化性质及生物学功能上可有较大差异 53 亚类 同一类Ig中由于铰链区氨基酸组成和二硫键数目的差异 可分为不同的亚类 亚类间抗原性的差异要小于类之间的差异 目前已发现人的 重链有 1和 2亚类 分别与L链组成IgA1和IgA2 重链有4个亚类 命名为IgG1 IgG2a IgG2b和IgG3IgM IgD和IgG 目前尚未发现存在不同的亚类Ig不同亚类也是由不同的恒定区基因片段编码 1 类和亚类 classesandsubclasses 54 2 型和亚型 typesandsubtypes 型 决定Ig型的抗原性差异存在于L链的恒定区 CL 根据CL抗原性的差异 氨基酸的组成 排列和构型的不同 分为 和 轻链 人类的 和 轻链之比约为2 1 而在小鼠 97 轻链为 型 型只占3 左右 55 亚型 根据 轻链恒定区个别氨基酸的差异又可分 1 2 3和 4四个亚型 1和 2在 轻链190位氨基酸分别为亮氨酸和精氨酸 3和 4在 轻链154位氨基酸分别为某氨酸和丝氨酸 2 型和亚型 typesandsubtypes 56 二 同种异型 allotype 指同一种属不同个体间的Ig分子抗原性的不同 在同种异体间免疫可诱导免疫反应 这种标记主要分布在CH和CL上同种异型抗原性的差别往往只有一个或几个氨基酸残基的不同 可能是由于编码Ig的结构基因发生点突变所致 并被稳定地遗传下来 因此 同种异型可作为一种遗传标记 57 三 独特型 idiotype 独特型为每一种特异性Ig可变区上的抗原特异性 不同抗体形成细胞克隆所产生的IgV区具有不同的抗原性 这是由于可变区尤其是超变区的氨基酸组成 排列和构型所决定的 在单一个体内所存在的独特型数量相当大 可达107以上 独特型的抗原决定簇称为独特位 可在异种 同种异体及自身体内诱产生相应的抗体 称为抗独特型抗体 antiidiotypicantibody aId 独特型和抗独型抗体在复杂的免疫调节中占有得要地位 58 抗体是体液免疫应答中发挥免疫功能最主要的免疫分子 抗体所具有的功能是由其分子中不同功能区的特点所决定的 二 抗体的功能 59 一 抗体分子不同功能区的特点 V区的功能 识别和特异性的结合抗原是由V区特别是高变区的空间构型所决定 Ig单体可结合两个抗原表位 为双价 Ab Ag 发挥免疫效应 B细胞膜表面的IgM和IgD是B细胞识别抗原的受体 60 C区的功能 激活补体结合细胞表面的Fc受体 调理作用 ADCC作用 介导I型超敏反应穿过胎盘和黏膜 一 抗体分子不同功能区的特点 61 二 抗体的功能 特异性结合抗原活化补体结合Fc受体通过胎盘 可从4个方面理解 62 1 特异性结合抗原 能够特异性地与相应的抗原结合如细菌 病毒 寄生虫 某些药物或侵入机体的其他异物 抗体分子有单体 双体和五聚体 因此结合抗原决定簇的数目 结合价 也不相同 Fab段为单价 不能产生凝集反应和沉淀反应F ab 2和单体Ig 如IgG IgD IgE 为双价双体分泌型IgA有4价五聚体IgM理论上应为10价 但实际上由于立体构型的空间位阻 一般只有5个结合点可结合抗原 63 2 活化补体 IgM IgG1 IgG2和IgG3可通过经典途径活化补体 当抗体与相应抗原结合后 IgG的CH2和IgM的CH3暴露出结合Clq的补体结合点 开始活化补体 凝聚的IgA IgG4和IgE等可通过替代途径活化补体 64 3 结合Fc受体 不同细胞表面具有不同Ig的Fc受体 当Ig与相应抗原结合后 由于构型的改变 其Fc段可与具有相应受体的细胞结合 IgE抗体由于其Fc段结构特点 可在游离情况下与有相应受体的细胞 如嗜碱性粒细胞 肥大细胞 结合 称为亲细胞抗体 cytophilicantibody 抗体与Fc受体结合可发挥不同的生物学作用 65 66 ADCC 2 发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用 67 3 介导I型变态反应 68 69 70 71 72 四 通过胎盘 在人类 IgG是唯一可通过胎盘从母体传给胎儿的Ig IgG能选择性地与胎盘母体一侧的滋养层细胞结合 转移到滋养层细胞的吞饮泡内 并主动外排到胎儿血液循环中 IgG的这种功能与IgGFc片段结构有关 如切除Fc段后所剩余的Fab并不能通过胎盘 IgG通过胎盘的作用是一种重要的天然被动免疫 对新生儿抗感染有重要作用 73 74 三 五类免疫球蛋白的特性与功能 IgGIgMIgAIgDIgE 75 1IgG IgG于出生后3个月开始合成IgG多为单体 半衰期约23天 占血清免疫球蛋白总量的75 80 IgG1 IgG2和IgG3的CH2能通过经典途径激活补体IgG是唯一能通过胎盘的抗体 通过Fc段与吞噬细胞表面FcR结合 发挥调理作用 与K细胞结合 发挥ADCC作用 能与SPA结合 具有抗菌 抗毒和抗病毒作用参与II III型超敏反应 76 为五聚体 是分子量最大的Ig 称巨球蛋白 IgM激活补体能力比IgG强天然血型抗体是IgMIgM是个体发育过程最早能产生的抗体 胚胎晚期已能合成 新生儿脐带血中若IgM水平升高 表明该儿曾有宫内感染IgM是抗原刺激后出现最早的抗体 故检测IgM水平可用于传染病的早期诊断 IgM是B细胞抗原受体的主要成分也可参与II III型超敏反应 2IgM 77 分为血清型和分泌型两种 血清型IgA主要由肠系膜淋巴组织中的浆细胞产生 而分泌型IgA SIgA 是由呼吸道 消化道 泌尿生殖道等处的固有层中浆细胞产生 主要存在于初乳 唾液 泪液 以及呼吸道消化道和泌尿生殖道黏膜表面的分泌液中 分泌型IgA的合成和主要作用部位在黏膜 3IgA 78 IgD是B细胞的重要表面标志B细胞的分化过程中首先出现SmIgM 后来出现SmIgD 他的出现标志着B细胞的成熟 4IgD 79 又称亲细胞抗体可与肥大细胞 嗜碱性粒细胞上的高亲和力Fc 受体结合 引起I型超敏反应 5IgE 80 第四节抗体基因和生物合成 1965年Dreyer和Bennet首先提出假说 认为Ig的V区和C区是由分隔存在的基因所编码在淋巴细胞发育过程中这两个基因发生易位而重排在一起 1976年日本学者利根川进 应用DNA重组技术证实了这一假说 利根川进由此获得1987年医学和生理学诺贝尔奖 81 目前认为 Ig分子是由三个不连锁的Ig Ig 和IgH基因所编码 Ig Ig 和IgH基因定位于不同的染色体上 编码一条Ig多肽链的基因是由在胚系中多个分隔的DNA片段 基因片段 经重排而形成的 82 免疫球蛋白基因定位 83 免疫球蛋白基因示意图 84 一 Ig重链基因的结构和重排 一 重链V区基因 二 重链C区基因 85 一 重链V区基因 H链V区是由V D J三种基因片段经重排后组成 86 1 H链V区基因组成 1 V基因片段 小鼠VH基因段约为250 1000 人的VH基因片段约为100 V基因片段编码VH的信号序列和V区靠N端98个氨基酸残基 包括CDR1和CDR2 2 D基因片段 D是指多样性 diversity D基因片段仅存在于H链 不存在于L链 小鼠DH共有12个片段 人的DH可能有10 20个左右 D片段编码H链CDR3中大部分氨基酸残基 87 1 H链V区基因组成 3 J基因片段 J是连接 joining 的意思 JH连接V基因片段和C基因片段 小鼠JH有4个 人有9个JH片段 其中6个是有功能的 J基因片段编码CDR3的其余部分氨基酸残基和第4个骨架区 88 2 H链V区基因的移位 首先发生D与J基因片段的连接形成D J 然后V基因片段与D J基因片段连接 H链V区基因的易位和连接是通过七聚体 间隔序列 九聚体识别信号和重组酶而完成的 89 二 重链C区基因 C基因片段小鼠H链区基因片从5 端到3 排列的顺序是C C C 3 C 1 C 2b C C 2 人H链C区基因的顺序为C C C 3 C 1 C 2 pseudo基因 C 2 C 2 C C C 2 90 三 Ig类别转换 classswitch 是指一个B细胞克隆在分化过程中 V基因不变 而CH基因片段重排 比较CH基因片段重排后基因编码的产物 其V区相同 而C区不同 即识别抗原的特异性相同 而Ig的类或亚类发生改变 Ig可能是通过缺失模式和RNA剪接两种机制来实现类别的转换 91 重链基因重排 92 93 94 95 96 三 膜表面Ig重链基因 膜表面Ig SmIg 是B细胞识别抗原的受体 SmIg和分泌性Ig的H链结构相类似 所不同的是smIgH名字的羧基端多含一段穿膜的疏水性氨基酸残基和胞浆区 97 98 二 Ig轻链基因的结构和重排 在H链基因重排后 L链可变区基因片段随之发生重排 在L链中 链基因先发生重排如果 基因重排无效 随即发生 基因的重排 L链无D基因片段 99 一 链基因的结构和重排 链基因是V基因片段 V J基因片段 J 和C基因片段 C 重排后组成 小鼠 V 基因片断约有250个 J 有5个 其中4个功能 C 只有1个 人 V 基因片断约有100个 J 有5个 C 也只有1个 V 与C 之间以随机方式发生重排 100 链基因重排 101 二 链基因的结构和重排 链基因也是由V J 和C 基因片段经重排后组成 小鼠有3个V 基因 4个J 和4个C 基因片段 它们的基因重排比较复杂 人V 约有100个 至少有6个C 与各自的J基因片段相连 人 链确切的重排情况还不清楚 102 三 抗体多样性的遗传学基础 机体对外界环境中种类众多抗原刺激可产生相应的特异性抗体 推算出抗体的多样性在107以上 抗体多样性主要由基因控制 胚系 germline 中众多的V D J基因片段在胚系上 Ig基因片段数量相当多 这是在长期进化中形成的 103 小鼠Ig多样性 举例 本表例举了小鼠H链和L链重排的多样性以及H链和 链相互随机配对所推算的多样性数目 多样性数目不包括VDJ连接多样性 N区插入和体细胞突变所增加的多样性数目 104 VDJ连接的多样性在L链基因重排过程中V J连接位点有一定的变异范围 例如VL基因片段3 端5个核苷酸CCTCC和JL基因片段5 端4个核苷酸GTGG连接时 总共9个核苷酸中只有6个核苷酸编码L链第95 96位氨基酸 因此可产生8种不同的连接方式 在H链基因重排过程中K J以及V D J连接时都可有连接多样性的存在 体细胞突变 somaticmutation 体细胞在发育过程中可发生基因突变 以长期体外培养的B细胞前体为例 每个细胞每个碱基对的突变率约为1 43 10 5 这种点突变主要发生在V基因 体细胞突变扩展了原有胚系众多基因片段重排的多样性 105 N区的插入在IgH链基因片段重排过程中 有时可通过无模板指导的机制 在重组后D基因片段的两侧即VH DH或DH JH连接处额外插入称为N区的几个核苷酸 N区不是由胚系基因所编码 在N区插入前 先通过外切酶切除VH DH或DH JH连接处几个碱基对 然后通过末端脱氧核苷酸转移酶 TdT 连接上N区 由于额外插入了N区 可发生移码突变 使插入部位以及下游的密码子发生改变 从而编码不同的氨基酸 大大地增加了抗体的多样性 L链H链相互随机配对例如 小鼠H链和 链随机配对后推算其多样性可达4 8 107 如果再加上H链与 链的随机配对其多样性应更多了 106 四 抗体基因的表达 基因重排的时间顺序等位排斥mRNA的加工抗体的合成和装配 107 等位基因排斥 108 等位基因排斥 109 抗体的合成与装配 110 为了研究抗体的理化性质 分子结构与功能 及应用抗体于临床疾病的诊断 治疗及预防都需要人工制备抗体 目前 根据制备的原理和方法可分为三类 多克隆抗体单克隆抗体基因工程抗体 第五节抗体的制备 111 多克隆抗体的概念 大多数天然抗原物质 如细菌或其分泌的外毒素以及各种组织成分等 往往具有多种不同的抗原决定簇 而每一决定簇都可刺激机体产生一种特异性抗体 多克隆抗体多个抗原决定簇 机体 多种抗体的混合物 112 在机体淋巴组织内可存在千百种抗体形成细胞 即B细胞 每种抗体形成细胞只识别其相应的抗原决定簇 当受抗原刺激后可增殖分化为一种细胞群 这种由单一细胞增殖形成的细胞群体可称为细胞克隆 clone 同一克隆的细胞可合成和分泌在理化性质 分子结构 遗传标记以及生物学特性等方面都是完全相同的均一性抗体 亦可称之为单克隆抗体 单克隆抗体 monoclonalantibody 为只针对某一特定的抗原决定簇 纯度高的抗体 单克隆抗体的概念 113 抗体产生过程 114 一 多克隆抗体 在早期传统的抗体制备方法是 将一种天然抗原经各种途径免疫动物 由于抗原性物质具有多种抗原决定簇 故可刺激产生多种抗体形成细胞克隆 合成和分泌抗各种决定簇抗体分泌到血清或体液中 故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物 称这种用体内免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体 也是第一代抗体 由于这种抗体是不均一的 无论是对抗体分子结构与功能的研究或是临床应用都受到很大限制因此如何能获得均一性抗体成为关注的问题 115 二 单克隆抗体 monoclonalantibody McAb 体内免疫法很难获得单克隆抗体如能将所需要的抗体形成细胞选出 并能在体外进行培养 就可以获得已知特异的单克隆抗体 116 1975年德国学者Kohler和英国学者Milstein 将小鼠骨髓瘤细胞和经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞在体外进行2种细胞融合 结果发现部分形成的杂交细胞既能继续在体外培养条件下生长繁殖又能分泌抗SRBC抗体 称这种杂交细胞系为杂交瘤 hybridoma 117 这种杂交瘤细胞 既具有骨髓瘤细胞能大量无限生长繁殖的特性又具有抗体形成细胞合成和分泌抗体的能力 这种抗体是由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体 故称之为单克隆抗体 应用杂交瘤技术可获得几乎所有抗原的单克隆抗体 只要这种抗原能引起小鼠的抗体应答 1975年德国学者Kohler和英国学者Milstein 118 119 单克隆抗体的优点 这种用杂交瘤技术制备的单克隆抗体可视为第二代抗体 单克隆抗体由于纯度高 特异性强 可以提高各种血清学方法检测抗原的敏感性及特异性 可在体外无限量生产完全同质的抗体 120 临床诊断 单克隆抗体的应用大促进了对各种传染病和恶性肿瘤诊断的准确性治疗 抑制器官移植排斥 治疗自身免疫疾病 生物导弹单克隆抗体亦可与核素 各种毒素 如白喉外毒素或篦麻毒素 或药物通过化学偶联或基因重组制备成导向药物用于肿瘤的治疗 是一种新型免疫治疗方法 有可能提高对肿瘤的疗效 检测 可用于对各种免疫细胞及其它组织细胞表面分子的检测 这对免疫细胞的分离 鉴定及分类及研究各种膜表面分子的结构与功能都具有重要意义 单克隆抗体的应用 121 原理 DNA合成主要途径旁路途径 利用次黄嘌呤 H 和胸腺嘧啶核苷 T 合成DNA 所需要的酶 次黄嘌呤 鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 HGPRT 胸腺嘧啶核苷激酶 TK 主要途径可被氨基喋呤 A 所阻断 应用杂交瘤技术生产单克隆抗体 122 原理 骨髓瘤细胞来源于BABC c小鼠的骨髓瘤细胞系没有合成Ig的能力体外具有无限生长繁殖的能力丧失合成HGPRT和TK的能力只能通过主要途径合成DNA在含有次黄嘌呤 H 氨基喋呤 A 胸腺嘧啶核苷 T 的HAT培养基中不能生长 应用杂交瘤技术生产单克隆抗体 123 原理 免疫淋巴细胞通常来源于BALB c小鼠的脾淋巴细胞具有合成Ig的能力具有合成HGPRT和TK的能力能通过主要途径和旁路途径合成DNAHAT培养基中能生长短寿 只能存活几天 体外不具有无限生长繁殖的能力 应用杂交瘤技术生产单克隆抗体 124 原理 融合剂Kohler和Milstein最早仙台病毒后来发现聚乙二醇 PEG 的融合效果更好 且避免了病毒的污染问题 应用杂交瘤技术生产单克隆抗体 125 原理 杂交瘤细胞具有合成Ig的能力 从免疫淋巴细胞获得 具有合成HGPRT和TK的能力 从免疫淋巴细胞获得 能通过主要途径和旁路途径合成DNAHAT培养基中能生长体外具有无限生长繁殖的能力 从骨髓瘤细胞获得 应用杂交瘤技术生产单克隆抗体 126 原理 饲养细胞单个或少数细胞在体外培养很难成活 必需加入其他细胞以增加细胞密度 维持其代谢 使之成活繁殖被加入的这种细胞称为 饲养细胞 最常用的小鼠腹腔巨噬细胞 应用杂交瘤技术生产单克隆抗体 127 原理 培养基基础培养基 主要有RPMI 1640或DMEM两种 不完全DMEM培养基 DMEM13 37g 超纯水980ml NaHCO33 7g 双抗溶液10ml 100 L G 溶液10ml 用1NHCl调试PH至7 2 7 4 过滤除菌 4 保存 完全DMEM培养基 不完全DMEM培养基80ml 小牛血清15 20ml 用于骨髓瘤细胞SP2 0和建株后的杂交瘤细胞培养 HT培养基 完全RPMI 1640或DMEM培养基99ml HT贮存液1ml HAT培养基 完全RPMI 1640或DMEM培养基98ml HT贮存液1ml A贮存液1ml 应用杂交瘤技术生产单克隆抗体 128 应用杂交瘤技术生产单克隆抗体 129 方法 免疫淋巴细胞的准备免疫是单抗制备过程中的重要环节之一目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化 增殖 以利于细胞融合形成杂交细胞 并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的机会因此在设计免疫程序时 应考虑 抗原的性质和纯度 抗原量 免疫途径 免疫次数与间隔时间 佐剂的应用以及动物对该抗原的应答能力等 没有一个免疫程序能使用于各种抗原 但常在末次免疫后2 4天取小鼠的脾脏制备免疫淋巴细胞 应用杂交瘤技术生产单克隆抗体 130 方法 骨髓瘤细胞的准备融合前骨髓瘤细胞生长状态 对成功得到杂交瘤是最为重要的用于融合的骨髓瘤细胞应处于对数生长期 应用杂交瘤技术生产单克隆抗体 131 方法 融合将1 108脾细胞与2 107 5 107骨髓瘤细胞SP2 0混于1支50ml融合管中 补加不完全培养基至30ml 充分混匀 1000r min离心5 10分钟 将上清尽量吸净在手掌上轻击融合管底 使沉淀细胞松散均匀 置40 水浴中预热用1ml吸管在1分钟左右 最佳时间为45秒 加预热至40 的50 P