狂犬病实验室检测技术

1,狂犬病实验室检测技术,2,一、实验室操作前的要求及准备二、实验室检测方法,3,实验室操作前的要求及准备,（一）实验室条件及生物安全操作要求（二）检测标本的要求（三）实验前准备,4,（一）实验室条件及生物安全操作要求,1、暴露前免疫 工作人员需要暴露前免疫 意外暴露于狂犬病毒时,必需立即报告部门负责人。2、P2实验室 操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在P2 或P3实验室内进行 (实验室固定毒在P2，病人或动物分离的街毒在P3）。3、P3实验室 对动物标本进行狂犬病毒分离时，必须在P3 以上条件的专业实验室中进行。 没有P3 实验室，严禁从事狂犬病毒分离工作。,5,4、个人防护 实验前要穿戴好防护服、眼镜、手套， 作好技术上的准备。5、防止气溶胶扩散 由于空气传播狂犬病毒已经得到证实，因此高速混悬或离心操作应在密闭状态下进行。6、实验后消毒处理 实验后要作好善后消毒处理, 狂犬病毒对脂溶剂（肥皂水、醚、氯仿、丙酮），4570%乙醇，碘制剂和四铵化合物敏感，操作完毕对操作台、实验材料等要用相应的消毒剂或高压蒸汽进行消毒处理。,6,1、采集时间 （1）应尽量采集较新鲜的标本。 （2）采集时无菌操作，避免标本污染2、标本保存 （1）尽量低温保存 （2）存放于无菌离心管中并进行编号。 3、标本类型 （1）唾液、脑脊液、眼角膜、咬伤处皮肤组织、脑组织、血清等。 （2）唾液、脑脊液、眼角膜、咬伤处皮肤组织、脑组织等均可用于 病原学检测，其中以脑组织中的阳性率最高； 血清和脑脊液可用于抗体的检测。,（二）检测标本的要求,7,（三）实验前准备,1、实验室及仪器的准备（略）2、各种试剂及材料的准备（略）,8,实验室检测方法,（一）DFA 法（二）巢式 PCR 法（三）其它检测方法（四）狂犬病诊断标准（WS281-2008）中的检测方法（五）美国 CDC 狂犬病实验室操作手册中的检测方法,9,（一）DFA 法（直接荧光抗体法） 检测狂犬病毒抗原,10,荧光抗体的染色方法可分为两类：直接法 荧光抗体直接与标本内的抗原反应, 优点简便、快捷、有效减少非特异性染色, 只适用于检测细胞内的抗原；间接法 荧光抗体作为第二抗体，与直接结合胞内抗原的第一抗体反应, 既可检测胞内抗原，也可以检测体液中的特异抗体 相对直接法操作步骤增多 DFA原理： 抗体蛋白分子 + + 抗原形成抗原抗体复合物通过荧光显微镜检测抗原 荧光素,11,操 作：,1、材料和仪器2、操作步骤i. 印片： 用酒精浸泡载玻片 30 分钟后取出、吹干， 分别取不同部位的脑组织剖面, 均匀的涂印在载玻片上； ii. 固定： 吹干后，取冷丙酮（4）室温固定 710 分钟； 取出吹干，进行步骤3，或置于 70冰箱保存； iii. 加荧光抗体： 将稀释好的荧光抗体滴加在固定好的抗原片上 （如果从 冰箱中取出，则待雾气散掉后再进行此步骤。）；,12,iv. 孵育： 将抗原片放在湿盒中， 37温育30 分钟； v. 洗片： 取出后，用缓流冲洗抗原片 35 秒， 再用 PBS 振洗 2 遍， 蒸馏水振洗 1遍，每次 2 分钟，吹干； vi. 封片镜检： 用 90甘油（ PBS）封片，加盖玻片，荧光显微镜观察。,搅拌器及染色缸,13,结果判断：,仔细观察每个视野的荧光强度，并结合不同视野的荧光分布，作出荧光强度的等级判断：阴性、可疑、 ：无荧光；/：极弱的可疑荧光；,无荧光“”,14,：荧光较弱，但清晰可见；,15,：荧光明亮，且多个视野均有分布；,16,：荧光闪亮，可见尼基氏小体清晰，且范围广泛；,荧光强度“” 荧光强度“”,17,18,（二）巢式 PCR 方法检测狂犬病毒核酸,传统的 PCR 检测模式一般需要三个步骤：制备模板：对待测标本进行核酸（DNA或 RNA）提取扩增过程：采用 PCR 或 RT-PCR 技术对核酸进行变性、退火、延伸扩增；检测过程：通过电泳等方法对PCR产物进行检测。 Sample Extract RNA or DNA PCR Electrophoresis photograph,19,巢式 PCR（nestedPCR）：,巢式 PCR的原理： 是设计两对引物，其中一对引物在另一对引物扩增产物的片段上，通过二次 PCR 反应对某个基因进行检测。通常第一次采用能扩增较大片段的引物，经过循环扩增后，将第一次扩增的产物作为模板进行第二次扩增。 优点： 特异性、灵敏度均比常规 PCR好。缺点： 比常规 PCR易污染。,20,巢 式 PCR 方法的操作：,1、RNA 提取：Trizol 法 （1）以下步骤在 P2 生物安全柜中进行 取不同位置的少量脑组织（50-100mg） 1000 l Trizol 先加 200 l（研磨均匀）然后加满至 1000 l 液体（唾液、尿液等）取 250 l 750 l Trizol LS -70过夜或颠倒 Epp 管 3040 次以便充分混匀内容物， 室温放置 5 分钟 （此步完可-70保存 1 个月）,21,（2） 以下步骤可在普通实验室进行 -70取出，室温融化加 200 l 氯仿， 快速颠倒 Epp 管数次（30 秒），使其呈淡粉红色 室温放置 3min 4离心，12000rpm，15min （其间标记新的离心管，每管中加 600 l 异丙醇） 取离心后水相 600 l，加入新的离心管中，轻柔混匀 室温放置 10 min （20放置 30 分钟效果更佳） 4离心，12000rpm，10min ,22,缓缓倒掉上清，用枪头轻轻吸去残存液体，可见少量沉淀 加 1ml 75乙醇（DEPC H2O 新鲜配制）洗涤沉淀 4离心 12000rpm，10min 缓缓倒掉上清，用枪头轻轻吸去残存液体，室温干燥数分钟 （加入 75乙醇至70可长期贮存 12 年） 脑组织的沉淀溶于 70ul DEPC H2O 中(2 个 EPP 管分装) 液体（唾液、尿液等）的沉淀 溶于 35ul DEPC H2O 中 直接进行逆转录或70贮存,23,注意事项： 1. 操作时一定戴口罩手套，保证离心管枪头无 RNA 酶 2. 一次提取核酸，样本数不要太多（10 个左右） 3. 加入氯仿后到加入异丙醇之前的操作应尽量快速且作用时间准确， 否则容易降低提取效率 4. 异丙醇和乙醇作用时间略长不影响结果 5. 加入异丙醇后所有的混均操作要轻柔，加液体时贴壁缓流，以免破 坏到所提核酸 6. 尽量缩短 RNA 在空气及室温的暴露时间，水溶的 RNA 一定要低温保存 7. 标本及时放回-20或-70,24,2、逆转录合成cDNA1）pd(N)6 稀释至 0.2ug/ul2）水浴预热至 65（其间标记反应管） 3）33ulRNA 液 65水浴 10min（其间准备冰盒或碎冰）4）冰浴 2min，瞬时离心。5）将液体转移至试剂盒反应管中 32ul，先不要混匀。6）再向反应管中加入 1ul pd(N)6 0.2ug/ul 或特异引物各 0.5ul，使总体 积达到 33ul，室温 1min，混匀，瞬时离心。 7）37水浴，60min 8） -20或-70保存 cDNA,25,3、巢 式 PCR：,26,27,琼脂糖凝胶电泳 1电泳槽中注入缓冲液 TAE 2将做好的琼脂胶放入电泳槽（加样孔在负极方向） 3Marker 加 5 ul，样品加 10ul5电压：100V6时间：30min 照相：凝胶成像仪/紫外透射仪,28,（三） 其它检测方法,1、ELISA检测抗原：包被抗体：用pH 9.6 的碳酸盐缓冲液稀释的抗狂犬病毒核衣壳IgG 包被96 孔酶标板，4过夜； 封闭：用含0.3牛血清白蛋白和5% 蔗糖的pH9.6 碳酸盐缓冲液封闭30分钟； 加待检标本：将采集到的标本研磨，用pH 7.4 PBS制成30的悬液，离心取上清加 入酶标板孔内，同时设阴性、阳性对照，200 l/孔，37孵育1 小时； 洗板：洗板四次；加酶标抗体：后加入纯化的酶标记抗狂犬病毒抗体200l/孔，37 l 小时；洗板：同上；加底物：加入酶反应底物，室温作用30 分钟；终止反应：加2M H2SO4 终止反应；观察结果：肉眼观察或酶标仪测定结果。,29,2、荧光灶抑制试验检测中和抗体,中和抗体： 为疫苗免疫力程度的评判指标 中和抗体水平等于或高于0.5IU/ml 血清，表示能得到有效的保护快速荧光灶抑制试验（RFFIT）： 为WHO 推荐的检测方法 制备细胞悬液( 110 cells/ml 的 BSR 细胞悬液) 稀释血清和病毒(待测血清、对照血清、标准血清、病毒固定毒CVS 株） 中和血清和病毒( 0.1ml血清 和标准病毒稀释液0.1 m1 ，37中和1.5 小时) 检测剩余病毒(每孔加入 50 l 制备好的细胞悬液，37、5% C02 过夜培养) 固定(弃掉培养液，PBS 洗一次，丙酮固定) 荧光抗体检测(干燥后，加荧光素标记的抗狂犬病毒抗体，37 30 分钟) 观察结果( PBS 洗3 次，荧光显微镜观察结果) 计算中和抗体滴度(实验组中能使荧光灶抑制50的血清最高稀释倍数，即为被检血清的中和抗体滴度),步骤,30,3、病毒分离,A. 细胞培养法分离病毒研磨标本 制成悬液（用PBS 或MEM ，30 ） 离心（ 4 2000r/min 离心20 m） 取上清接种细胞（鼠神经瘤细胞、Vero 细胞或BHK21 细胞） 吸附（ 2 h） 加维持液 孵育(37 、5C02 、45 天) 鉴定B. 乳小白鼠接种法分离病毒研磨标本 制成悬液 离心 取上清接种乳鼠脑内（ 12 日龄） 饲养 观察发病情况(未发病的鼠保留至21 天后作DFA检测),31,4、ELISA检测狂犬病毒抗体ELISA方法测定的是总抗体，不代表具有保护性的中和抗体水平其结果仅供参考。5、染色镜检检测内基氏小体,32,（四）狂犬病诊断标准（WS281-2008）中的检测方法,1、DFA法检测狂犬病毒抗原 意义： 阳性结果，表明有狂犬病毒感染，有确诊意义。2、ELISA检测狂犬病毒抗原 意义： 检测到狂犬病毒抗原阳性有诊断意义。3、细胞培养方法分离狂犬病毒 意义： 阳性结果表明有狂犬病毒感染，有确诊意义。,33,4、RT-PCR检测狂犬病毒核酸,原理： 狂犬病毒为负链RNA病毒，PCR前需要经过逆转录酶作用，合成一条cDNA链（RT）,再进行PCR。检测步骤： 1）病毒RNA的提取 2）逆转录合成cDNA 3）PCR扩增 4）电泳意义： 阳性结果表明有狂犬病毒感染，有确诊意义。,34,5、狂犬病特异性抗体检测,狂犬病特异性抗体： 在自然感染情况下，狂犬病毒通过带有病毒的动物唾液进入机体伤口在入侵部位基本上不增殖（一般也不侵入血流） 故不能形成病毒血症。 在感染后，狂犬病毒或其抗原不能与机体免疫系统广泛接触故机体无免疫应答反应（针对狂犬病毒）。 晚期，狂犬病破坏血脑屏障 大量病毒抗原进入血流刺激机体产生大量特异性抗体。 因此，通常在发病早期血清中查不到抗体或抗体滴度很低，只在临床疾病的晚期出现。,35,A. 快速荧光灶抑制试验（RFFIT） 测定中和抗体意义： 中和抗体水平等于或高于0.5IU/ml 血清，表示能得到有效的保护B. ELISA 检测狂犬病毒抗体意义： 1）接种过狂犬病疫苗的患者抗体滴度大于0.5IU/ml ，表明已获得一定的保护。 2）未接种过疫苗的患者的抗体滴度大于1IU/ml ，且近期有4倍增高，可考虑狂犬病。 3）部分狂犬病患者在临死前抗体滴度也可能异常增高。,36,（五）美国 CDC 狂犬病实验室操作手册中的检测方法,1、DFA 检测狂犬病毒抗原 当 以下情况发生时，需要重复（证实性）检测: 1）包涵体颗粒典型，但视野不到 10，或视野大于 10，但抗原分布极 度稀疏（如每个视野中只有 1 到 2 个包涵体颗粒）； 2）包涵体颗粒典型，但染色强度较弱且缺乏特征性； 3） 包涵体颗粒不典型，但染色强度好 （如结构大小均匀、形态规则）； 4） 非特异性荧光颗粒掩盖了少量狂犬病毒颗粒的特异性染色； 5） 两种试剂的检测结果或两个技术人员的结果判定不一致。当进行重复性确证性DFA检测时，通常采用两种以上的检测试剂进行同比实验。,37,2、 RT-PCR检测核酸3、细胞培养法分离病毒：鼠神经瘤细胞（MNA） 目 的：