浸矿微生物选育及鉴定.doc

题目：浸矿微生物的选育及鉴定浸矿微生物的选育及鉴定摘要本综述结合当今生物冶金的研究现状，介绍了国内外浸矿微生物的选育方法，及应用各种技术对各种浸矿微生物进行鉴定和群落结构分析，这些方法的应用对生物冶金领域的研究及生产实践具有重要意义。关键词：浸矿微生物 选育 鉴定 随着我国矿产资源的不断开发利用，富矿资源日趋贫乏，以贫、细、杂为突出特点的难选冶矿石，所占比例不断上升，致使常规的选冶方法，在技术和经济两方面都面临严峻的挑战。对于铜、金、铀等金属需求量的不断增加以及成本的节约化，促使冶金技术的不断进步，由此产生了生物冶金技术。生物冶金技术具有工艺简单、流程短、装备简单、投资小、成本低、污染轻、资源消耗量小以及能够理低品位矿等诸多优点，适合社会可持续发展的要求，因此，生物冶金技术的开发研究，己经成为矿产资源利用领域的前沿研究课题。随着生物冶金技术研究的不断深入，学者对在生物浸矿体系中起关键作用的浸矿微生物的研究越来越多。本文将对浸矿微生物的选育和鉴定技术进行综述，为浸矿微生物的研究提供一定的参考，以便能更好的利用生物冶金技术。1 浸矿微生物浸矿微生物是可以直接或间接地参与金属硫化矿或氧化物的氧化和溶解过程的微生物。细菌对矿物分离的作用主要来源于：1)微生物代谢的分泌物对目标矿物的选择性吸附、中和、氧化还原等作用；2)微生物选择性地将目标矿物成分吸收进入代谢环节，然后以另外一种形态或价态将矿物成分释放于环境中；3)微生物本身对目标矿物的选择性吸附、中和等作用；4)微生物分泌物及代谢过程对目标矿物复杂的吸附、氧化还原等物化作用。根据温度范围，在生物冶金过程中起作用的浸矿菌主要可分为以下3类：(1)嗜中温细菌(Mesophile)。最佳生长温度3045 ，主要包括Thiobadllus ferrooxidans，Thiobadllas thiooxidans，Leptospirillum ferrooxidans。(2)中等嗜热细菌(Moderate thermophile)。最佳生长温度45 55 ，主要有Sulfobacillus菌属；已鉴定的有Acidimicrobium ferrooxidans，Sulfobacillus thermosulfidooxidans，Sulfobacillus acidophilus。(3)高温嗜热菌(Extreme thermophile)。最佳生长温度60 85 ，包括Sulfolobus：60 70 ；Sulfolobus likearchaea：65 85C。其中，嗜中温菌和中等嗜热菌已成功应用于硫化矿的生物氧化中，在低于45 时以嗜中温菌为主；在45 60 范围内，以中等嗜热细菌为主；在40 45 的范围内可能有些重叠。高温嗜热细菌在实验室已进行了扩大试验，但还未进行大规模的工业应用。2. 浸矿微生物选育的意义与方法21 选育的意义菌种选育包括选种和育种。选种即根据微生物的特性，应用各种筛选方法从自然界和生产中选择需要的菌种；育种即进一步提高已有菌种的某种性能，使其更符合需要，一般通过诱变和杂交来实现。变异菌株中通常只有少数在某些性能方面比初始菌株有所提高，育种工作中也存在选种问题，选出的新菌种有待通过育种过程提高其性能，选种与育种有紧密联系。目前，微生物冶金中的硬件设施和工艺流程已经比较成熟，但浸矿微生物生长速度慢，只有大肠杆菌的万分之一，且在实际浸矿体系中，表面活性剂、重金属离子、卤素离子等含量超过一定浓度时，将抑制细菌生长，甚至造成菌体死亡。因此，要想充分发挥微生物浸矿方法的优势，提高其矿物浸出效果，除了进一步改进工艺外，更重要的是要加强高效菌株的选育工作，改良菌种以获得能适用多种矿石、适应能力强、氧化活性高并能大规模应用的高效工程菌。2.2 选育方法2.2.1 驯化育种与其它生物相比，微生物对环境有很强的适应能力。微生物的生长是其与外界环境相互作用的结果，在逐渐适应环境的变化过程中基因会发生突变，在适合生长发育的新环境下成为优势种 驯化按目的不同可分为活性和抗性驯化，方法是使用目的矿物不断转代培养或增加有毒离子的转代培养。刘亚洁等报道铁一硫氧化细菌经过较高浓度含氟离子培养基长时间培养驯化后，筛选到的菌株可在含氟148 gL的溶浸液中一昼夜即可将5 gL Fe完全氧化。当前大多数细菌堆浸场所用菌种为驯化菌种，如张卫民等报道了 永平铜矿浸矿细菌经过4次驯化后，溶液中Fe2+ 的转化速率明显提高，Fe的沉淀率明显减少，而pH逐渐下降。浸矿细菌对金属离子的抗性主要由质粒基因编码。目前质粒抗性机理研究还不够深入。而张东晨等 对质粒在硫杆菌中普遍存在的观点提出了质疑，研究结果表明， 氧化亚铁硫杆菌对Fe 、S等的氧化能力可能只是与拟核染色体DNA有关，而其遗传物质就是拟核染色体DNA。2.2.2 诱变育种诱变育种是利用物理或化学的因素(如紫外线、亚硝基胍、微波等诱变剂)处理微生物群体，促使少数个体细胞的遗传物质(主要是DNA)的分子结构发生改变，使基因内部的碱基配对发生差错，从而引起微生物的遗传性状发生突变。根据应用的要求，可以从突变株中筛选出某些具有优良性状的菌株供科研和生产使用。目前这方面的报道较多，采用的诱变手段各异，均取得较好效果。如徐晓军等报道了 经紫外线诱变的浸矿细菌对黄铜矿的浸出率比原始菌提高了46 以上，到达浸出终点的时间也缩短了5lO天。蒋金龙等用亚硝基胍(NTG)对氧化亚铁硫杆菌进行诱变育种，发现诱变后菌株的氧化活性在原先的基础上提高了4倍。熊英等报道经驯化后的氧化亚铁硫杆菌用紫外线、微波作为诱变剂进行复合处理诱变选育Tf菌的氧化活性由末被驯化、诱变前的007 g(I h)提高到318 g (I h)。诱变育种所获得的优良菌株要应用到工业实际中去，必须是遗传稳定的突变菌株，亦即在菌种保存和应用过程中其突变或抵制基因突变的频率要很小，这就要求在育种过程中作一段长期的培养和观测，反复传代观测其性状稳定性； 当培养稳定时，还要对保存的菌种作一定时期的复活培养，分离其未回复突变株、淘汰其同复突变株，并确定适当的保存方法和时期。2.2.3 接合、转化和转导通过供体菌和受体菌完整细胞间的直接接触而传递大段DNA的过程称为接合，也称细菌“杂交”。革兰氏阴性细菌最为常见。有接合作用的细菌是有性别分化的，与一种F质粒有关，根据F质粒的有无和存在方式可分为4种类型： F (雄性)菌株；F-(雌性)菌株；Hfr(高频重组)菌株；F菌株。F质粒的切割与整合可在群体间传递基因，产生新的遗传类型。受体菌直接吸收供体菌的DNA 片段，然后同源配对交换，从而获得供体菌的部分遗传性状的现象称为转化。转化后的受体菌称转化子。转化与亲缘关系和感受态的建立有关。通过缺陷噬菌体的媒介，将供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，从而使后者获得了前者部分遗传性状的现象称转导。转导是由于噬菌体的错误包装发生的。转导后的受体菌叫转导子。2.2.4 细胞融合通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程称为细胞融合。细胞融合在革兰氏阳性菌中比较容易，在革兰氏阴性菌中成功的例子不多。其原理和主要过程是两个有选择性遗传标志的突变体，在高渗溶液中，用适当的脱壁酶(如细菌可用溶菌酶或青霉素处理)除去细胞壁，再将形成的原生质体离心聚集，并加入促融合剂PEG(聚乙二醇)促进融合，然后在高渗溶液中稀释，涂在能使其再生细胞壁或进行分裂的培养基上，待形成菌体后，通过影印接种法，将其接种到各种选择性培养基上，最后鉴定它们为重组子。2.2.5 基因工程育种基因工程育种足指利用基因工程方法对生产菌株进行改造而获得高产 程菌，或是通过微生物间的转基因而获得新菌种的育种方法。来源不同的氧化亚铁硫杆荫菌株对金属硫化矿物的浸出效果是不一样的，说明氧化 铁硫杆菌具有复杂的遗传特性。贝雷A D、汉斯福德G s对两株氧化亚铁硫杆菌的染色体基因组大小进行r研究，发现其大小为29 Mb左右 。据报道，在氧化亚铁硫杆菌的ghnS基因的C端发现了一个代号为Tn5468的转座子，其序列与Tn7相似。在来源于 同地点的茼株染色体上存在两种2O3O个拷贝的重复序列，IST1和IST2能存染色体DNA 中移动，使菌落发生表型转移口 。1994年Peng等利用大肠杆菌IncP族质粒转移到氧化亚铁硫杆茼中并表达其功能的特性，使该质粒上的两个抗性基因(卡那霉素和链霉素基凶)和抗砷基因(Asr)被成功地转移到氧化亚铁硫杆菌中。徐海岩等u l利用氧化 铁硫杆菌抗砷上 菌Tf 59(pSDX3)处理含砷金精矿，获得了较好的抗砷效果。赵清等通过利用DNA体外重组技术，构建了含有强启动子、可在tra基因诱动下转移的组成型表达的抗砷质粒pSDRA4。通过接合转移的方式将其导入专性自养极端嗜酸性喜温硫杆菌Acidithiobacillus c II IdW 中，构建了冶金工程菌Acidithiobacillus caldus(pSDRA4)，重组质粒在喜温硫杆菌中具有较好的稳定性(重组质粒保留76%以上，野生菌相比，构建的喜温硫杆菌工程菌抗砷能力明显提高，从10 mmolL高到45 mmolL.2.3 改良育种需注意的问题在进行生物改良育种过程中，为得到高效稳定的工业用菌，就必须用有效的育种程序，适于浸矿菌生长的育种培养基，育种方法的正确选择以及育种过程中菌株筛选的有效性。(1)有效的育种程序可以在不同诱变处理后，能在后处理中以恰当的指标反应出最有效的正突变菌株，以此菌株再培养、富集、自然淘汰出负变菌株，选择出最好的正突变菌株，应用于工业实际中去。(2)微生物的分离纯化和菌株筛选和微生物的生理生化研究都需要正确的培养基，特别是在育种中所使用的固体培养基。常规琼脂有机凝固剂对自养浸矿菌有抑制作用，不利于菌株筛选。硅胶无机凝固剂虽无抑制性，但操作性能很差。因此在进行改良育种时，驯化耐受有机物能力强的混合菌株进行定向选育育种；也可比较各种凝固剂的效果，寻找比较理想的凝固剂；或者将有机凝固剂的抑制分子进行纯化处理。(3)针对菌种改良的诱变或基因工程方法，不同的菌种，选择正确的方法。诱变主要分为物理诱变和化学诱变。对于Tf菌而言，因其在化学诱变过程中，有机物对其生长有强烈的抑制作用，因此一般采用物理诱变就能得到高效稳定的诱变工业菌种。(4)改良育种所获得菌株应用到工业实际中去，必须是稳定的突变菌株。亦即在菌种保存和应用过程中其回复突变或抑制基因突变的频率要很小，这要求在育种过程需要长期的培养和观测，反复观测其性状稳定性。在实际菌种改良过程中，亦可从培养环境，如温度、pH值、重金属离子浓度等条件考虑，做到快速有效筛选和改良。随着生物技术不断发展和应用分子生物学手段的不断提高，获得高效稳定的、繁殖速度快、氧化能力强、环境适应能力强的基因工程菌是完全可能的。3. 浸矿微生物鉴定3.1 常规方法微生物鉴定的常规方法，是指通过纯培养，获得纯菌株后，将测定的细胞的形态学、生理学、生态学的各种指标，与权威性的菌种鉴定手册比较，获得菌种的分类信息 。早期的鉴定，就是通过此方法进行的，但是，这种方法需要的时间长，而且有些浸矿微生物难以获得纯培养。Johnson 曾通过平板培养的方式，发现有机物对专性自养菌Acidithiobacillus ferrooxidans有毒害作用，导致它很难在固体琼脂培养基上生长，但通过夹层培养或引入异养菌Acidiphilum，可获得纯的At.ferrooxidans. 由此可以推断，早期获得的纯的Atferrooxidans，有可能是Atferrooxidans和Acidiphilum 的混合菌株。3.2 免疫学方法3.2.1 免疫荧光法免疫荧光法是一种使结合有荧光素的抗体与抗原进行反应，借以提高免疫反应灵敏度和适合显微镜观察的免疫标记技术。Baker和Mills 将荧光抗体(Fluorescent antibody，FA)和2-(p-Iodopheny1)一3一(pNitropheny1) 一5-Phenyltetrazolium hloride(INT)结合，此技术又称为FAINT。他们利用FAINT技术研究了酸性和非酸性环境中Thiobacillus ferrooxidans 的分布。通过比较FAINT技术，荧光抗体染色和MPN (Most Probable Number)，结果表明，MPN低估活细胞数13个数量级，而荧光抗体染色估计过高。3.2.2 斑点免疫测定法该方法是Jerez提出来的，可以快速特异性鉴定Tferrooxidans、Lferrooxidans和Thio- bacillus thiooxidans。该方法的基本过程为：首先，将要鉴定的细菌以硝酸纤维素滤膜过滤，使细菌呈点状分布在膜上。然后，用一次抗体和细胞反应，再与酶结合的可以和一次抗体特异结合的二次抗体反应。酶通过催化无色底物产生有色底物，斑点中要鉴定细菌的数量与有色底物的多少成正比。同时，做一细菌数已知的对照试验，通过计算机图像分析软件，来确定斑点中细菌的数量。该方法可以检测的最低限为每个斑点103细胞。3.3 分子生物学方法对于浸矿微生物的检测，免疫学方法是针对某一种已知菌或多个菌种的检测。但是，随着人们对于浸矿微生物的认识逐渐加深，发现能够浸矿的细菌种类很多，而且存在一些未知的菌种。因此，针对单一菌种或者多个菌种的检测，已不能说明浸矿环境中的微生物种群的问题，便逐渐发展出了可以检测微生物种群的技术，这也是随着现代分子生物学的技术而发展起来的，特别是PCR技术。通过PCR扩增后，原有的DNA 可以扩增106以上，因此，对于分析微量且浓度低的样品特别有效。3.3.1 16S rRNA基因序列分析由于16S rRNA作为原核生物分类的一个标准，因此，将16S rRNA基因全长测序后与现有的数据库比较，就可知道原核生物的分类信息。Okibe等 用此方法研究了搅拌罐浸出操作中的微生物群落，共分离到4种菌：Atcaldus、Leptospirillum sp、Sul fobacillus sp和Ferroplasma。这些原核生物的相对数量，在三个采样的反应器中是变化的。随着矿物的氧化，Ferroplasma成为优势菌，而且在第三个反应器中，占到了平板分离的99%上。证明混合铁氧化菌和硫氧化菌，可加速硫化矿物的氧化，也表明随着矿物的溶解，微生物种群也会随着改变。3.3.2 构建克隆文库克隆文库的构建分为以下几步：首先提取样品核酸，PCR扩增16S rRNA基因，扩增产物与载体相连，然后将载体转入大肠杆菌，通过固体平板培养的方式，挑选阳性菌落，组成克隆文库。再提取阳性克隆的质粒，测序后与NCBI中的数据库进行比较，就可知道文库中的菌种及数量。郝春博通过16S rRNA基因文库的构建，对浸矿微生物生态学进行研究。表明某反应器内嗜酸菌的组成，主要包括五种嗜酸细菌Lferriphilum，Acaldus，Sulfobacillus spAlicyclobacillus sp. 和革兰氏阳性嗜酸铁氧化菌，其中前三种是稳定存在的。3.3.3 PCRSSCP (PCRSingle Stranded Conformation Polymorphism)单链构象多态性(Single Stranded Conformation Polymorphism) 的原理，是基于不同单链DNA 的不同折叠构象会影响电泳进程中的迁移率。通过PCR扩增出的DNA，经变性产生两条互补的DNA 单链， 由于碱基序列及空间构象的不同，在非变性聚丙烯酰胺凝胶中呈现不同的带型。Foucher等 应用SSCP研究了含钴黄铁矿柱浸和搅拌罐浸出中细菌种群演化，分别研究了吸附在矿石上以及浸出液中的细菌组成。浸出液中，在实验的第一阶段，优势菌为Tcaldus，之后被Lferrooxidans代替。吸附在矿石上的优势菌始终为是L ferrooxidans。Sulfobacillus thermosulfidooxidans不是很恒定，似乎在柱浸时生长更好。3.3.4 PCRDGGE (PCRDenatured Gradient Gel Electrophoresis)变性梯度凝胶电泳(Denatured Gradient Gel Electrophoresis) 的基本原理，基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度一致的凝胶位置时，DNA发生部分解链，电泳迁移率下降，当解链的DNA链中有一个碱基改变时，会在不同的时间发生解链，因影响电泳速度变化过程而被分离。Demergasso等采用DGGE对智利的一个低品位粗制硫化铜矿堆浸中的微生物群落进行了一年的监测。第一阶段主要是Atferrooxidans和古细菌Sulfurisphaera。第二阶段(从225338天)主要是Leptospirillum 和Ferroplasma 。第三阶段(从598到749d)Sulfobacillus成为优势菌，Ferroplasma是唯一检测到的古细菌。3.3.5荧光原位杂交(Fluorescent In Situ Hybridizatlon， FISH ) FISH技术的基本原理为：将寡核苷酸探针用荧光染料标记，再使之与固定在载玻片上的微生物样品杂交，将未杂交的荧光探针洗去后，用共聚焦激光扫描显微镜或普通荧光显微镜进行观察和摄像。用这一方法，可以避免细菌的培养，清楚并方便地观察到样品中细菌的细胞数量和空间位置，而且可以利用不同的寡核苷酸探针，同时对不同类群的细菌，在细胞水平上进行原位的定性定量分析和空间位置识别。Bond等 应用FISH 技术，研究了美国Richmond矿酸性矿山排水中的微生物群落，结果表明，在极低的pH值及高离子强度的地方，Ferroplasma spp为优势菌。在许多矿泥中检测到Leptospirillum spp， 而Sulfobacillus spp在温度较高的地方是优势菌。3.3.6 多种方法组合应用为了全面了解微生物群落组成、演替的信息，可将多种方法组合应用，这样可以避免方法本身所带来的不可避免的偏差。Kinnunen和Puhakkan应用FISH 和DGGE，研究了产生Fe抖的流化床反应器中微生物组成，结果表明，Lferriphilum为优势菌，古细菌Ferroplasma acidiphilum 只有不到1%。4. 结语结合菌种选育在生物冶金中的应用现状，今后关于浸矿微生物菌种的选育可以做以下的研究工作：理浸矿微生物的诱变育种；生物选育中诱变育种的作用机理，以便更好地指导诱变操作和生产实践，更好地控制诱变条件；综合考虑菌种的筛选和培育及其它影响因素，取不同的菌株进行正交实验，实现最优控制；矿微生物的分子生物学领域基础性研究；因工程育种技术构建出能大规模应用于工业的高效工程菌。浸矿微生物的鉴定，就是要搞清楚浸矿过程中微生物群落的组成以及演替情况。浸矿环境中的微生物，由于受环境因子的影响，组成复杂，有时存在一些未知的微生物。现在通常采用现代分子生态学方法，对浸矿微生物进行鉴定，PCRSSCP 、PCRDGGE和FISH是现在应用最广的三种方法，已成功应用于堆浸、柱浸、搅拌罐浸出中细菌的鉴定。PCRSSCP和PCRDGGE可以快速检测和鉴定环境中数量比例大于1 的细菌，FISH 虽不能鉴定未知微生物，但可以更加直观的反映原位的微生物组成分布情况，可对微生物群落进行定量估计，而多种方法的组合使用，可获得详细的微生物的群落结构信息。参考文献1刘亚洁李江等铀矿石生物浸出中氟对铁一硫氧化细菌的影响J.有色矿冶.2006(2)：18212 张东晨，张明旭等.硫微生物氧化亚铁硫杆菌遗传特性的分子生物学试验J.煤炭学报2006(1)：1041073余水静 郭燕华 宋秋