溶血磷脂与卒中预警

溶血磷脂与卒中预警 传统的血小板活化标志物 第一类 是血小板颗粒膜上的糖蛋白。血小板被激活时，其颗粒膜与质膜发生融合，颗粒膜蛋白，如 CD62（ P选择素， GMP-140 ） 、 CD63（溶酶体膜相关糖蛋白 3， lysosomal-membrane-associated glycoprotein 3 ） 在质膜上表达，成为活化血小板的分子标志。 第二类 是血小板质膜表面变化的糖蛋白表位。如 GP b/ a(CD41/61)的 PAC1表位（ activated 2b-3， PAC-1） ，它仅在血小板活化时才因构象变化而显露出来。 第三类 是颗粒释放物如 颗粒释放的 CD 40L、血小板第 4因子（ PF4）、血小板球蛋白（ -TG）、纤维蛋白原、假血友病因子（ von Willebrand factor， vWF）、纤维连接蛋白、血小板衍生生长因子（ PDGF）等。 血小板膜糖蛋白 （ GP） 血小板膜糖蛋白分为 质膜糖蛋白 和 颗粒膜糖蛋白 ， 前者包括 GP b- - 、 GP b- a、 GP a- a等，后者包括 CD62P和 CD63。CD62P又称 P-选择素、 GMPl40，在未活化的血小板上， CD62P分子仅表达于颗粒膜上。活化后， CD62P分子在质膜呈高表达。 CD63在静态血小板仅分布于溶酶体膜，血小板活化后随脱颗粒而表达在血小板质膜表面。因此 CD62P和 CD63在质膜上高表达被视为血小板活化的分子标志物。 目前多采用荧光素标记的 抗血小板 GP的特异性单克隆抗体作为探针，流式细胞术测定血小板 GP。 传统的血小板活化标志物 ADP和花生四烯酸 （ AA） 诱导的最大血小板聚集率 （ MPAR） 用于评价阿司匹林抵抗，反映血小板活化程度。 血栓烷素 A2（ TXA2） 产生于血小板，能收缩血管，促进血小板聚集。内皮细胞产生的 前列腺素 I2（ PGI2） 可扩张血管，抑制血小板聚集。 TXB2和 6酮前列腺素 F1a（ 6-k-PGF1a）分别是 TXA2和 PGI2具有代表性的代谢产物，用于评价血小板功能。 TXB2/6-k-PGF1a（ TP比值 ） 能反映两种物质的代谢状态。 传统的血小板活化标志物 LDL-C与血小板活化呈正相关（ LDL ox-LDL)。 血小板分布宽度 （ Platelet distribution width， PDW） 及血小板平均体积（ Mean platelet volume， MPV） 血小板衍生微颗粒 （ platelet-derived microparticles） 血小板 -单核细胞聚合物 （ platelet-monocyte aggregates） GP-VI二聚体反映胶原对血小板的活化 （ dimers of GPVI represents an important events leading to platelet activation by collagen. GPVI dimers could represent a new marker to analyze platelet reactivity） 传统标记物的局限性 Commonly used blood markers do not reflect the earlier pathophysiologic processes of mass platelet activation， plaque rupture, and thrombus formation. 以往血栓形成前预警方法的局限性 以往临床上已经采用以预警为目的检测方法 （ “ 血栓预报 ” ）。 主要分为 物理化学、生物物理、血液生化 等几个方面。 物理化学方法 的代表是 70年代末期开展的以血液流变学为主要指标的 “ 中风预报仪 ” ，即测定离体血液的一系列物化性质，如各种粘度等； 生物物理方法 如测定血小板的聚集率等； 血液生化 如测定血脂、胆固醇、各种脂蛋白、同型半胱氨酸、 hs-CRP等。 上述方法的共同特点是：它们反映的是静态血液性质的（物理的、化学的）一些改变。其中血粘度、血小板的聚集率等是在体外条件下测得的，而 血液在体外和体内的物化性质受环境影响差别很大，难以控制。 以往血栓形成前预警方法的局限性 在体内，正常情况下血液不会凝固，而在体外，无论操作多么小心，很难使血液完全不凝固。另外，现行作为预警的很多生化物质本身并不直接与血栓形成的过程有关，它们可能在某些方面对血栓形成的过程有影响，都不能反映血栓形成过程是否已经启动。 以上方法在理论上不能作为预警的基础，更不能称为预报，多数只是危险因素而已。在实践上，它们与临床表现符合程度较差，不足以指导诊断，对临床预防治疗的指导意义也有限。 寻求卒中预警方法的新思路 血栓形成是多步骤的系列过程，如果在这一过程起始阶段的某一环节能够找到一种指示，例如特异性较强的 标记物 ，就可以根据它的出现、增高来判断血栓形成过程是否已经启动，从而进行预警。 优点： 首先它确切反应体内血栓形成的过程开始启动，是一种 “ 临近指示 ” 。同时不能象血液流变学、聚集率等那样，受诸多体外因素的影响。 LPA 、 LP-PLA2是代表性标记物。 溶血磷脂酸：血小板活化新标记物 近年来对 溶血磷脂酸 （ Lysophosphatidic acid, LPA） 的研究发现，它就是一个较好的血栓形成前释放的分子标记物。 LPA在血小板被激活时大量释放到血液中，释放的 LPA又能反过来促进更多的血小板聚集，这一正反馈特点，构成了 LPA作为血栓形成早期预警分子的基础。此外，在 LDL-C轻度氧化过程中产生 LPA。 研究结果证实： 缺血性卒中高危人群、 TIA患者、未抗栓的心房纤颤患者、分水岭梗死患者、不稳定动脉粥样硬化斑块患者等血浆LPA含量均显著升高。 溶血磷脂酸的结构 溶血磷脂酸（ 1-脂酰 -2-sn-甘油 -3-磷酸）是目前已知结构最简单的甘油磷脂，其基本分子结构为一甘油骨架，其 sn-1位为一脂酰链， sn-2位为一羟基（溶血）， sn-3位为一磷酸基团。 脂酰链长度差异， LPA是一个家族。 LPA是血清中的正常组分之一，细胞内及体液中产生的 LPA与血清白蛋白及脂蛋白结合，并保持其生物活性。 新鲜全血、血浆及脑脊液中 LPA含量很低或不能检测到。 体内的 LPA主要由活化的血小板及低密度脂蛋白（ LDL）在轻度氧化的过程中产生。除活化的血小板外，成纤维细胞、脂肪细胞、内皮细胞、某些炎症细胞及癌细胞、神经细胞等也可产生 LPA。 活化的血小板是血清中 LPA的主要来源。 溶血磷脂酸受体 目前在人类基因组中已克隆了 8个 Edg基因（内皮分化基因），其中三个（ Edg-2，Edg-4， Edg-7）编码 LPA受体，分别称为 LPA1（与肺、肾脏纤维化有关）、 LPA2（对抗放射线损伤、结肠癌进展、 SMC迁移）、 LPA3（胚胎种植）；余下五个（Edg-1， Edg-3， Edg-5， Edg-6， Edg-8）编码神经鞘氨醇 1-磷酸（ sphingosine-1-phosphate， S1P）受体（芬戈莫德， Fingolimod， S1P受体调节剂用于治疗多发性硬化）。 LPA与跨膜 G蛋白（ Gi、 Gq、 G12/13）耦联受体结合，活化相应的信号传导通路，对血管内皮细胞、血小板、血管平滑肌细胞 (VSMCs)、单核 /巨噬细胞等发挥生物学效应。 生物学效应包括： 刺激细胞增殖与生存、促进血小板聚集、增加血管内皮细胞的通透性、血管平滑肌细胞迁移增值、肿瘤细胞侵润等。 自毒素 LPA对血管壁细胞及血小板的作用 LPA对 血管壁细胞 （ 内皮细胞、平滑肌细胞 ） 及 血小板 具有广泛的生物学效应，通过不同的 G蛋白耦连受体（ GPCRs）介导的信号通路，从多方面促进动脉粥样硬化和血栓形成。 LPA在动脉粥样硬化的发生与发展、冠心病及卒中的发生等方面有极重要的作用，由于它与 血小板活化、 oxLDL的产生、内皮细胞功能障碍、炎症细胞的活化与浸润、炎性细胞因子与黏附分子的表达、氧化应激、基质金属蛋白酶（ MMP）的表达与活化、细胞的增殖与凋亡调节、斑块破裂与栓子形成等事件密切相关 ， 决定了它在动脉粥样硬化与心脑梗死病理生理学中的关键和纽带作用。 LPA的合成 体内 LPA的合成主要源于下列途径： 1）血小板活化后，在磷脂酶 A2、磷脂酶 D等作用下，水解膜磷脂产生。 2）低密度脂蛋白（ LDL）在轻度氧化的过程中产生，且产生的 LPA位于轻度氧化低密度脂蛋白（ moxLDL）分子的表面。 3）溶血磷脂酰胆碱（ LPC）在溶血磷脂酶 D（ lysoPLD， autotaxin，自分泌运动因子，自毒素 ATX ）作用下产生 LPA。这是血浆中 LPA的最主要来源。 4）除活化的血小板外，成纤维细胞、脂肪细胞、内皮细胞、某些炎症细胞及癌细胞等也可产生 LPA。 （膜）磷脂 二脂酰甘油 溶血磷脂 磷脂酸 3-磷酸甘油 单脂酰甘油 2、 LPA是 LDL致血管内皮改变的活性成份 氧化低密度脂蛋白 （ oxLDL） 在动脉粥样硬化及并发症的发生中起关键作用 ， oxLDL可活化内皮细胞和血小板 。 Siess W 等研究发现 ，LPA在 LDL轻度氧化过程中产生 ， 它是轻度氧化低密度脂蛋白 （moxLDL） 中的活性部分 ， 可启动血小板的活化 、 刺激内皮细胞应激纤维和细胞间缝隙的形成 。 活体研究发现 LPA聚集在动脉粥样硬化斑块内 ， 是基本的活化血小板的脂类分子 ， 在人颈动脉粥样硬化斑块的脂质核心区含有最高浓度的LPA， 当斑块破裂时暴露的 LPA促进血栓形成 。 动脉粥样硬化斑块破裂，暴露 LPA，活化血小板，促进血栓形。 动脉粥样硬化斑块及纤维帽形成， LPA位于脂质核心 动脉粥样硬化斑块破裂，暴露 LPA，活化血小板，形成血栓 1、溶血磷脂酸促进内皮素 (ET-1)的释放，因此溶血磷脂酸在脑血管痉挛中也起重要作用。 2、 LPA与红细胞作用，启动红细胞的血栓前状态。 3、 LPA启动并活化纤维蛋白原与血小板受体的连接，有利于血栓形成。 4、 LPA启动溶血磷脂酰胆碱乙酰化。 5、 LPA比血栓素 A2（ TXA2）对于血小板聚集的作用更强。 LPA促动脉硬化和血栓形成的其它机制 W. Siess / Biochimica et Biophysica Acta 1582 (2002) 204215 血管平滑肌细胞增殖迁移 血管内皮细胞通透性增加 轻氧化低密度脂蛋白 动脉粥样硬化 冠心病、卒中 轻氧化低密度脂蛋白促动脉硬化效应实际上是LPA的作用 脂蛋白相关性磷脂酶 A2 Lipoprotein-associated phospholipase A2， Lp-PLA2 脂蛋白 脂蛋白是血脂在血液中存在、转运及代谢的形式； 分为乳糜微粒、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白； 脂质不溶于水，必须与蛋白质结合以脂蛋白形式存在，才能在血液循环中运转，因此，高脂血症常为高脂蛋白血症 (hyperlipoproteinemia) 的反映。 高密度脂蛋白降低也是一种血脂代谢紊乱，因而称之为脂蛋白异常症更为全面、准确地反映血脂代谢紊乱状态。 成熟脂蛋白呈球形，中间是甘油三酯和胆固醇酯，表面组分为载脂蛋白、游离胆固醇和 磷脂 。 脂蛋白的氧化修饰是动脉粥样硬化的基础。 脂蛋白（ LDL）结构模式图 （磷脂酰胆碱） 磷脂酶 (phospholipase,PL)概述 根据磷脂酶对磷脂水解部位的不同可将磷脂酶分为 4类： 磷脂酶 A1（ PLA1） 磷脂酶 A2（ PLA2）： 选择性作用于甘油磷脂 sn-2位的 酯键 （ -COO-基团，由羧基 “ -COOH”与羟基 “ -OH”脱水而成） 。 磷脂酶 C（ PLC） 磷脂酶 D（ PLD）；溶血磷脂酶 D（ Lyso-PLD, ATX） 甘油磷脂 磷脂是一类含有磷酸的脂类，机体中主要含有两大类磷脂，由甘油构成的磷脂称为甘油磷脂；由神经鞘氨醇构成的磷脂，称为鞘磷脂。 其结构特点是：具有由磷酸相连的取代基团 (含氨碱或醇类 )构成的亲水头和由脂肪酸链构成的疏水头。 在生物膜中磷脂的亲水头位于膜表面，而疏水尾位于膜内侧。 酯键 Sn-2 PLA2 取代基团 H PLA2 溶血磷脂酰胆碱 胆碱 PA与 LPA PLA2作用位点，加氢变成 OH， 溶血磷脂 甘油 甘油三酯 磷脂酰胆碱（卵磷脂） 甘油骨架 脂肪酸 脂肪酸 Sn-1 Sn-3 Sn-2 Lyso-PLD, ATX 甘油磷脂 N末端 Sn-1 磷脂酶 A2超家族 磷脂酶 A2（ Phospholipase A2， PLA2），即磷脂 -2-酰基水解酶，是专一催化甘油磷脂 Sn-2位酯键，酶解产物为 溶血磷脂和脂肪酸 。 广泛参与人体细胞内外信号的传递及炎症、多种相关性疾病病理反应。其生理功能包括细胞信号传递及产生 20多种类脂质介质，改造磷脂结构，促进机体坏死组织自动消失，肺泡表面活性物质代谢等。 磷脂酶 A2超家族 所有的 PLA2都有一个最基本的作用，就是水解甘油磷脂 Sn-2位脂肪酸，释放两种代谢物： 自由脂肪酸（非酯化脂肪酸，如花生四烯酸）和溶血磷脂。 花生四烯酸，经环氧物酶和脂氧化物酶代谢，主要形成前列腺素 (PGE)、白三烯和脂毒素类，直接或间接作用于靶细胞参与炎症反应。因此，长期以来都认为， PLA2在炎症中扮演的角色是破坏细胞膜稳定性，起损伤作用。 1995年以后发现 PLA2具有抗菌活性。 PLA2除了上述作用外，蛇毒中的 PLA2常具有其他一些药理活性，如肌肉毒性、突触后神经毒性、心脏毒性、溶血毒性等。 Phospholipase A2 structure/function The superfamily includes 15 groups comprising four main types including； 四种主要的磷脂酶 A2 Secreted sPLA2： 分泌型磷脂酶 A2 ，与二十烷类产生、炎症及抗菌作用有关。 Cytosolic cPLA2 ： 胞浆型磷脂酶 A2，花生四烯酸 (AA)代谢具有优先选择性。 Calcium-independent iPLA2： 钙离子不依赖磷脂酶 A2，作为看家酶参与膜的重建 Platelet activating factor (PAF) acetyl hydrolase/oxidized lipid lipoprotein associated （ Lp-PLA2）： 血小板活化因子乙酰水解酶（氧化脂蛋白相关性磷脂酶 A2），以 PAF和氧化磷脂为底物。 磷脂酶 A2, PLA2 PLA2 hydrolyzes the fatty acid from the sn-2 position of membrane phospholipids. In vivo, the sn-2 position of phospholipids frequently contains polyunsaturated fatty acids, and when released, these can be metabolized to form various eicosanoids（二十烷类） and related bioactive lipid mediators. PLA2不仅在维持膜磷脂的稳定性方面非常重要，而且在调节花生四烯酸（ AA）的释放与代谢方面起关键作用。它在调节促炎性脂类调质如前列腺素（ PGs）、白三烯（ LT）的产生，以及脂质代谢与信号传导方面同样具有重要作用。 磷脂酰胆碱 羟基廿碳四烯酸 脂蛋白相关性磷脂酶 A2 脂蛋白相关性磷脂酶 A2（ Lipoprotein-associated phospholipase A2， Lp-PLA2）又称血小板活化因子乙酰水解酶（ PAF-AH），以PAF和氧化磷脂为底物。是近年来发现的一种与动脉粥样硬化和缺血性心脑血管病相关的磷脂酶 A2超家族（新的炎性标记物）。 Lp-PLA2主要由炎症细胞（单核细胞 /巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、 T细胞、活化的血小板等）产生， 其催化产生的促炎产物溶血磷脂酰胆碱 （ LysoPC）和氧化非酯化脂肪酸（ OxFA），具有促进动脉粥样硬化作用。 脂蛋白相关性磷脂酶 A2 Lp-PLA2属于扩大的磷脂酶 A2 超家族，其编码基因（ PLA2G7）于 1995年首次被克隆，它具有 12个外显子，定位于 6号染色体 p21.212。 Lp-PLA2为 50kDa具有 441个氨基酸残基的丝氨酸脂酶，其生物学活性不依赖于 Ca2+，最初由于发现其可以降解血小板活化因子（ PAF），因此它又被称为血小板活化因子乙酰水解酶（ PAF-AH）。 血浆中， 约 80%的 Lp-PLA2与低密度脂蛋白（ LDL）结合 。其余 20% 的 Lp-PLA2与高密度脂蛋白（ HDL）或极低密度脂蛋白（ VLDL）结合。 联合应用原位杂交和免疫组化技术发现兔及人类动脉粥样硬化斑块中的巨噬细胞可表达高水平的 Lp-PLA2 mRNA和蛋白。 LPA LysoPLD 磷脂酰胆碱 氧化修饰磷脂酰胆碱 溶血磷脂酰胆碱 氧化脂肪酸 oxFA 内皮细胞、单核细胞或平滑肌细胞产生的活性氧或自由基团使低密度脂蛋白氧化修饰而形成氧化修饰的低密度脂蛋白 LDL在 氧 化 过 程中， 与 LDL结 合的 Lp-PLA2作用于 LDL表面的甘油磷脂， 产 生具有促炎作用的 LysoPC和 OxFA 甘油磷脂 LysoPC OxFA Lp-PLA2 Lp-PLA2促动脉粥样硬化的机制 1、促进 LDL的氧化修饰； 2、作用于 oxLDL，产生溶血磷脂酰胆碱（ LysoPC）和自由脂肪酸（ OxFA） ；后者活化炎症细胞，产生炎性细胞因子； 3、促进吞噬细胞捕获 oxLDL，形成泡沫细胞； 4、 Lp-PLA2在斑块坏死核心区显著表达，促进巨噬细胞凋亡，加快易损斑块破裂； 5、 LysoPC抑制凋亡细胞清除，因而加剧血管壁的炎症反应，促进坏死核心的扩大； 脂蛋白 相关性 磷脂酶 A2 “脂蛋白”： 主要指 LDL。 “相关性”： （ 1） 约 80%的 Lp-PLA2与 LDL结合；（ 2） LDL在氧化过程中，与 LDL结合的 Lp-PLA2作用于 LDL表面的甘油磷脂，产生具有促炎作用的产物 LysoPC和 OxFA； “磷脂酶 A2”： 作用于 LDL表面的甘油磷脂 sn-2位的酯键，产生溶血磷脂酰胆碱和自由脂肪酸。 溶血磷脂酰胆碱和自由脂肪酸： 具有促炎作用，促进动脉粥样硬化，加快易损斑块破裂；对冠心病、卒中有预警作用。 LPA LysoPLD 内含磷脂酰胆碱 溶血磷脂酰胆碱 Lp-PLA2 Lp-PLA2： 心血管病预警分子 Lp-PLA2的两个主要来源， 一是 循环中与 LDL结合的 Lp-PLA2经动脉内膜直接进入内膜下动脉粥样硬化病灶中， 二是 动脉粥样硬化斑块中的炎性细胞的新合成。 测定血浆中 Lp-PLA2的含量或活性可作为独立危险因子，预警发生冠心病及缺血性卒中的危险性（ FDA批准）。 Lp-PLA2抑制剂（ 他汀类 、 Darapladib）对降低高危心脑血管病患者的发病率具有重要意义。 LP-PLA2联合 LPA检测的预警价值 临床流行病学研究及 Meta分析结果表明 , LP-PLA2 是评价冠心病和卒中风险的一个独立危险预测因子。 局限性： LP-PLA2既具有抗炎活性，又具有促炎活性；其确切作用机制有争议。 其主要代谢产物 LysoPC是溶血磷脂酸的主要底物来源。 LP-PLA2是 LPA的上游催化酶之一。 LP-PLA2联合 LPA检测在动脉粥样硬化及冠心病、卒中的预警价值正在研究中。 Lp-PLA2 is a marker of inflammation Circulating Lp-PLA2 is a marker of inflammation that plays a critical role in atherogenesis; its inhibition may have antiatherogenic effects. Studies from the West of Scotland Coronary Prevention Study (WOSCOPS), Monitoring Trends and Determinants in Cardiovascular Diseases (MONICA) and Rotterdam cohorts have shown that Lp-PLA2 is an independent predictor of coronary heart disease (CHD), and the association is not attenuated upon multivariate analysis with traditional risk factors and other inflammatory markers. Studies in subjects with coronary artery disease (CAD) have also shown associations between Lp-PLA2 and cardiovascular risk. At least two recent studies have shown that Lp-PLA2 is a risk predictor for stroke. Overall, epidemiological studies suggest that measurement of Lp-PLA2 in plasma may be a useful in identifying individuals at high risk for cardiovascular events. Vasc Health Risk Manag. 2006 June; 2(2): 153156. Lp-PLA2： 含量与活性 Lp-PLA2 mass含量 is measured by an enzyme immunoassay in human plasma (the PLAC test) (Dada et al 2002). In addition, Lp-PLA2 activity活性 can also be measured in human plasma (Tselepis et al 2002). LP-PLA2 是评价冠心病和卒中风险的一个独立的危险预测因子 大量研究表明 , LP-PLA2 是评价冠心病和卒中风险的一个独立的危险预测因子。Ballantyne等 通过对 Lp-PLA2和 C反应蛋白（ C-reactive protein, CRP）水平与传统危险因素进行评价以探讨其与缺血性卒中的关系。应用比例风险模型，对社区动脉硬化风险（ ARIC）研究中包括 12 762例健康受试者的前瞻性病例队列进行分析，观察 6年。 结果显示，在校正性别、种族和年龄后， 194例卒中患者的平均 LP-PLA2水平和 CRP水平显著高于 812例非卒中病例，而低密度脂蛋白胆固醇（ LDL-C）水平却无显著差异。 在校正所有传统危险因素以及 CRP、体重指数及甘油三酯后， 升高的 Lp-PLA2水平与卒中呈独立相关性，经 68年的随访发现， Lp-PLA2水平升高者，卒中的发生率约是非升高者的 2倍。 Lp-PLA2水平和 CRP水平均升高者，较两者均正常者卒中的发生率增加 10倍。 部分研究结果 WOSCOPS研究 在苏格兰西部冠心病预防研究（ WOSCOPS）中，采用病例对照研究方法， 580例发生心脏缺血事件的患者与年龄、吸烟史匹配的1160例对照组进行比较。 结果发现，随 Lp-PLA2水平升高，冠状动脉缺血事件也随之增加，与较低 Lp-PLA2水平的患者相比， Lp-PLA2水平较高者发生冠心病的危险增加 2倍。多变量分析表明， Lp-PLA2不依赖于传统危险因素和 CRP、血白细胞计数、纤维蛋白原等炎症性标记物，可作为预测冠心病发生的独立危险因子。 MONICA研究 在德国南部开展的 MONICA研究进一步证实了 Lp-PLA2与 CHD之间的联系。 19841998年 14年间对 934例年龄在 4564岁的健康人群进行追踪随访，期间有 97人发生了冠脉缺血事件，发生冠脉缺血事件者其 Lp-PLA2基线水平显著高于未发生者（ 295 11g/L比 263 79g/L， P