角化细胞培养研究进展

角化细胞(KC)培养研究进展,提纲,KC来源及分化过程KC的作用KC培养方法滋养层细胞培养无滋养层细胞培养影响KC培养的的因素霍乱毒素(CT)、表皮生长因子(EGF)和钙离子(Ca2+),一、KC来源及分化过程,KC来源及分化过程,皮肤主要由表皮和真皮组成，中间由基底膜隔开；表皮由上至下分别为角质层、颗粒层、棘层和基底层；KC主要来源于基底层。,1.皮肤结构和KC来源,KC来源及分化过程,表皮干细胞,定向祖细胞,终末分化KC,凋亡KC,10-14d,干细胞含量较少，通常处于静息状态，分裂缓慢，短时间获取大量干细胞难度大；而定向祖细胞具有分化潜能且分裂较快的优点。,桥粒和角化包膜形成,2.KC分化过程,二、KC的作用,KC的抗菌作用,1. KC通过PRR识别病原体,Kollisch等(2005)用RT-PCR方法发现KC可表达不同的TLR亚型。,PGN、poly (I:C)和flagelli可分别与KC的TLR2、TLR3和TLR5结合，从不同程度刺激KC分泌IL-8,说明KC可通过TLR识别细菌上的病原相关分子模式(PAMP)，分泌IL-8等物质清除病原体。,KC的抗菌作用,2. KC分泌AMP杀灭病原体,Glaser等(2005)用抗菌测试试验发现抗菌肽S100A7可特异性的杀死大肠杆菌。,ONG等(2005)研究发现LL-37能有效杀灭葡萄球菌。,KC在抵抗外来微生物入侵中的另一个重要作用是产生大量的AMP。阳离子抗菌肽主要有LL-37、防御素和S100蛋白家族(Harder and Schroder, 2005)。,三、KC的培养方法,KC培养最早始于1967年(Briggaman等，1967) ，随后人们陆续培养出鼠(Marvin等，1971)、兔(Liu等，1978)和狗(Wilkinson等，1987)等的KC。使用的培养方法包括滋养层培养法和无滋养层培养法。,滋养层细胞培养,1.以3T3细胞作为滋养层,1975年，Rheinwald等首次成功地在体外连续培养人正常KC。 他们把射线灭活的鼠3T3细胞作为滋养层，将胰蛋白酶消化后的单个KC接种于其上，发现KC能明显抑制3T3细胞，且自身生长良好，并将3T3滋养层细胞不断推至培养皿边缘。,图中红色为KC，蓝色为3T3细胞,滋养层细胞培养,1.以3T3细胞作为滋养层,Alain等(1986)用3T3滋养层培养法成功培养了人头皮毛囊KC。,5d,18d,滋养层细胞培养,2.以成纤维细胞作为滋养层,Alain等(1989)首先介绍了用自体成纤维细胞代替3T3细胞作为滋养层，成功培养了人头皮毛囊KC。,真皮成纤维细胞,丝裂霉素C,或射线,有丝分裂后细胞,成纤维细胞滋养层,KC,接种,6d,3weeks,滋养层细胞培养,优点：细胞接种密度低、增殖速度较快、细胞生长稳定；而且灭活的3T3细胞自身无生长能力，有利于接种的KC生长增殖。弊端：一反面可能会造成KC和3T3细胞的混合污染，另一方面存在着将3T3细胞DNA遗传信息整合入增殖的KC内的危险。,无滋养层细胞培养,Wilkinson等(1987)率先用无滋养层方法成功分离培养了狗KC。,皮肤组织,分离酶,4孵育18h,表皮,KC,培养、传代,20孵育45min,特定培养基,吸管吹吸,无滋养层细胞培养,Hager等(1999)用无滋养层方法成功分离培养了小鼠KC，并将其传至第19代，但只有前10代细胞具有分化能力。,真皮,胶原酶,纱布过滤、离心,混合细胞,成纤维细胞,成纤维细胞条件培养基,HCM,EMEM.06,EMEM.06(1:1),KC培养基,无滋养层细胞培养,Caldelari等(2000)在Wilkinson方法基础上成功分离培养了17.5d小鼠胚胎KC，并在传至第61代依然保持分化活性。,17.5d小鼠胚胎皮肤,分离酶,defined keratinocyte-SFM,表皮,KC,培养、传代,剪碎,胰酶消化,defined keratinocyte-SFM,提高Ca2+浓度后，Keratin和E-cadherin表达呈阳性，且浆膜外形成排列紧密的角蛋白网络，细胞间形成稳定的连接结构，说明细胞仍保持分化活力。,无滋养层细胞培养,有学者认为无滋养层培养的细胞缺少分化标记物(中间丝蛋白、张力原纤维和桥粒)的表达(Prignano等，1999)；小鼠KC在培养30代后会出现非整倍型染色体。,四、影响KC培养的因素,人为因素接种密度、传代时间培养基无血清培养基、霍乱毒素(CT)、表皮生长因子(EGF)和钙离子(Ca2+),影响KC培养的因素,1.霍乱毒素(CT),CT是分子量为8400D的蛋白质，由A和B两个亚基组成。B亚基可将腺苷酸环化酶结合到细胞表面，A亚基可激活腺苷酸环化酶。,Green(1978)发现浓度为10-11-10-9M的CT均可有效促进细胞生长。,影响KC培养的因素,1.霍乱毒素(CT),说明当细胞密度较低时，CT可提高cAMP浓度并促进细胞增殖；当细胞密度增高时，CT可降低cAMP浓度，从而抑制高密度细胞生长。 Natsuko等(1982),细胞密度较低时，CT可促进DNA和蛋白质合成；细胞密度增加后，CT抑制DNA和蛋白质合成,向培养基中加入浓度范围为10-14-10-8M的CT后6h，可成百倍的提高胞内cAMP浓度。,影响KC培养的因素,2.表皮生长因子(EGF),EGF是分子量为6045D的多聚肽，最先由Cohen(1962)从鼠颌下腺中分离，并发现其具有促进新生小鼠表皮生长和成熟的作用。,Rheinwald等(1977)将EGF加入KC培养基后发现，EGF不仅可以促进KC生长，还能增加其寿命。,影响KC培养的因素,2.表皮生长因子(EGF),Wilkinson等(1987)也发现EGF可促进狗KC增殖，而且EGF和CT具有协同效应。,影响KC培养的因素,2.表皮生长因子(EGF),Miguel等(2001)的发现说明EGF主要通过提高端粒酶的活性来延缓细胞衰老。,细胞每次分裂，端粒会缩短一点，当端粒消耗完之后，细胞便会凋亡；而端粒酶可阻止端粒缩短，也就是说端粒酶可延缓细胞凋亡。,影响KC培养的因素,3.钙离子(Ca2+),Hennings等(1980)发现在低Ca2+浓度(0.09mM)中，KC以单层形式聚合，并形成“铺路石”样；在高Ca2+浓度(1.14mM)中时，KC会向垂直方向角化并形成4-5层细胞，随后从培养皿上脱落，接种后5d，增殖细胞比例不到60%。,0.09mMKC增殖,1.14mMKC已分化,最先被发现生长受到钙离子影响的细胞是鼠3T3细胞(Boynton等，1974)和人WI-38成纤维细胞(Boynton等，1977) 。作者发现，当钙离子浓度低于0.5mM时，这两种细胞生长均受到抑制。,影响KC培养的因素,3.钙离子(Ca2+),Ca2+浓度小于0.3mM时，细胞数量增多；大于0.3mM时，细胞数量减少。,Ca2+浓度小于0.3mM时，含有角化包膜细胞比例较少；大于0.3mM时，含有角化包膜细胞比例增多。,说明Ca2+浓度大于0.3mM时，Ca2+会抑制细胞增殖并促进细胞分化。,Steven,等(1983),影响KC培养的因素,3.钙离子(Ca2+),1，25-D3可通过诱导PLC-1表达来促进involucrin和 transglutaminase表达,1，25-D3可通过诱导PLC-1表达来提升胞内Ca2+浓度。,说明1，25-D3可通过诱导PLC-1表达来提升胞内Ca2+浓度，最后促进involucrin和 transglutaminase表达，引起细胞分化。,Xie,等(2001）,影响KC培养的因素,霍乱毒素(CT) 当细胞密度较低时，CT可提高cAMP浓度