血栓与止血的筛选试验及其临床应用.ppt

血栓与止血的筛选试验及其临床应用 上海交通大学医学院附属瑞金医院王鸿利王学锋 迄今 检测血栓与止血的试验逾百种 大致可分为筛选试验 确诊试验 排除试验和基因分析等四大类 本文仅就筛选实验 如出血时间 BT 血小板计数 PLT 活化部分凝血活酶时间 APTT 凝血酶原时间 PT 纤维蛋白 原 降解产物 FDPs D 二聚体 D D 血小板功能分析仪 PFA 100 血栓弹力图 TEG 的检测其临床应用作一简述 图1血管内皮细胞与止血系统 一 一期出血缺陷筛检试验的应用 1 一期止血缺陷是指血管壁和血小板异常所引起的止血功能缺陷 主要是由于毛细血管壁通透性 脆性增加或血小板数量 质量异常所致的出血 2 临床特点出血以皮肤 黏膜为主 重者可伴有内脏出血 但肌肉 关节等组织出血罕见 对压迫 缝合 外用止血剂或输注血小板治疗有效 但对血浆和血浆凝血因子制品无效 3 筛选试验出血时间 BT 血小板计数 PLT 筛选试验1 出血时间 BT 模板式刀片法 出血时间测定器法 反映毛细血管壁与血小板相互作用 毛细血管的完整性 收缩性以及血小板数量 功能的实验 参考范围 TBT法 6 9 2 1min 临床意义 BT延长 9 0min 1 PLT 与BT 呈负相关 PLT愈 BT愈 2 血小板功能异常 血小板无力症 巨血小板综合征 灰色血小板综合征等 3 部分凝血因子缺乏 低 无纤维蛋白原血症 血管性血友病 vWD 等 4 遗传性出血性毛细血管扩张症 5 药物 阿司匹林 ASA 氯吡格雷 玻立维 和阿昔单抗等 方法学评价上海瑞金医院对126例ITP和20例vWD患者检测BT结果列于表1 对BT的三种方法比较见表2 表1ITP和vWD应用两种BT法检测的结果 P 0 01 表2三种BT检测方法的比较 2 血小板计数 PLT 单位容积的循环血液中所含血小板的数量 109 L 方法 1 直接血小板计数法 普通显微镜法 相差显微镜法 2 血液分析仪 电阻抗法 光散射法 3 流式细胞仪法 参考范围 国内 85 320 109 L 成人 通常是100 300 109 L 临床意义 1 血小板减少 100 109 L PLT 50 109 L 出血少见 50 30 109 L 外伤性出血 20 109 L 自发性出血 常需输注血小板制品 血小板减少原因 生成减少 破坏增多 消耗过多 分布异常等 2 血小板增多 400 109 L PLT400 600 109 L 需观察 PLT 600 109 L 需治疗 PLT 600 109 L 需血小板分离 血小板增多原因 骨髓增生性疾病 反应性血小板增多 方法学评价ICSH推荐 一般用血涂片法观察血小板分布并与计数核实 1 草酸胺稀释 相差显微镜计数血小板 2 流式细胞术计数 经国际11个实验室用CD41 CD61验证 该法准确度 精密度很好 可作为自动血细胞分析仪的校准和PLT减少的准确性的验证 图2一期止血缺陷的筛选试验 图3先天性初期止血异常的实验室检查 获得性初期止血异常的实验室检查 二 二期止血缺陷筛检试验的应用 1 二期止血缺陷是指凝血障碍和抗凝物质所引起的止血功能缺陷 主要是由于凝血因子缺乏或体内产生病理性抗凝物质所致出血 2 临床特点出血以肌肉 关节为特点 也可有内脏 皮肤出血对血浆 血浆凝血因子制品有效 但对压迫 外用止血剂和输血小板疗效欠佳 3 筛选试验活化部分凝血活酶时间 APTT 血浆凝血酶原时间 PT 图4凝血系统及其筛选实验 1 活化的部分凝血活酶时间 APTT APTT是内源凝血途径的常用和较敏感的筛选试验 参考范围 传统的是31 43s 目前随着仪器和试剂的开发 其参考值不一 尚难统一 正常对照值 传统的须测对照值 以测定值较对照值延长 10s为异常 目前也未统一 APTTR 患者APTT 正常对照APTT比值 尚未得出参考范围 尚未推广应用 临床意义 1 内源性凝血途径因子缺陷 F 血友病A F 血友病B F F PK和HMWK等遗传性缺乏症 2 内源性凝血途径因子抑制物存在 常见F F 抑制物 狼疮抗凝物 LA 应选用鞣花酸为激活剂更敏感 3 药物所致异常 常见肝素 患者APTT 正常人APTT比值为1 5 2 5为治疗范围 输注库血引起凝血病等 4 纤溶活性增强 尤其是多见于继发性纤溶亢进 DIC 而原发性纤溶很少延长 方法学评价 1 激活剂 白陶土 硅藻土和鞣花酸的敏感性比较 见表3表3不同激活剂对APTT敏感度比较 2 凝血时间检测的敏感性比较 瑞金医院对血友病患者凝血时间的敏感度作比较 延长率 APTT95 硅管法CT100 ACT100 而试管法CT为70 故目前用APTT为筛选实验简单 方便 实用 2 血浆凝血酶原时间 PT PT是外源凝血系统常用和较为敏感的筛选实验 参考范围 传统法为12 1s 11 13s 目前 随着仪器和试剂不同 参考范围也有不同 尚未统一 正常对照组 传统法为测定值较正常对照组 3s为异常 目前也未统一 PTR参考范围 1 00 0 05 已在应用 临床意义 1 PT延长 见于遗传性 获得性外源凝血系统的凝血因子缺乏 获得性常见于DIC 依K因子缺乏 口服抗凝剂 肝病 循环血抗凝物质 肝素 FDP 抗因子抗体 2 PT INR多用于监测口服抗凝剂 华法林 INR 1 5提示抗凝剂无效 INR1 5 2 0用于预防 INR2 0 2 5常规抗凝 INR2 5 3 0重度抗凝 INR 3 0易致出血 方法学评价 1 Hct 30 或 50 抗凝剂和血液的比例应按下式调整 表4 抗凝剂量 mL 100 Hct 血液量 mL 0 00185表4Hct对PT和APTT测定结果的影响 2 凝血活酶 组织因子 兔脑 人脑 重组组织因子 rTF 对PT的结果 不尽相同 rTF 人脑 兔脑 3 缓冲剂其维持血浆pH 防止易变因子失活 如果无缓冲剂 血浆pH增加 PT延长 三 筛选试验的联合应用 主要是PT APTT和PLT的联合应用 1 PT N APTT和PLT N 2 PT APTT N 和PLT N 3 PT APTT 和PLT N 4 PT APTT 和PLT 5 PT N APTT N 和PLT 6 有出血症状 但PT N APTT N 和PLT N 图3先天性凝血异常的实验室检查 表获得性凝血性障碍项目的选择和应用 四 纤溶活性增强筛选试验的应用 1 原发性纤溶性增强指组织型纤溶酶原激活物 t PA 或尿激酶型纤溶酶原活物 u PA 的活性增强所致纤溶性亢进2 继发性纤溶活性增强几乎都见于DIC 是指因子 a激活激肽释放酶原 PK 生成激肽释放酶 KK KK激活纤溶系统所致纤溶活性增强 3 筛选试验纤维蛋白 原 降解产物 FDP 测定D 二聚体测定 D D 图5FDP和D D的生成 1 纤维蛋白原 Fg 和纤维蛋白 Fb 降解产物 FDPs 测定指纤溶酶同时降解Fg和Fb产生的FDPs 1 定性试验 胶乳凝集法 阴性 血清FDP含量 10 g mL 血浆FDP含量 5 g mL 尿液FDP含量 2 g mL 阳性 血清FDP含量 10 g mL 血浆FDP含量 5 g mL 尿液FDP含量 2 g mL 2 定量试验 ELISA法 包被于固相的FDP抗体与样本中FDP 抗原 结合 加入酶标抗体后形成夹心复合物 呈显色反应 参考值 5 g mL 2 D 二聚体 D D 测定指纤溶酶特异性降解纤维蛋白 Fb 所产生的降解产物 1 定性试验 胶乳凝集试验 阴性 无凝集颗粒者 即D D含量 0 5 g mL阳性 有凝集颗粒者 即D D含量 0 5 g mL半定量 以 0 5 g mL 0 5 g mL 阳性时的最大稀释倍数 2 定量试验 ELISA法 参考范围 0 5 g mL 3 定量试验 胶体金法 将血浆加入检测卡孔内 血浆中D D吸附于包被有D D单抗膜中 再加入D D单抗 胶体金耦联物溶液 膜中D D将与金标抗体发生结合反应 用光笔阅读仪读数 参考范围 0 3mg L 临床应用 1 纤溶活性增强筛检试验的应用FDP正常 D D正常 多数为正常人 提示无纤溶过度现象 FDP阳性 D D正常 多数为FDP的假阳性或原发性纤溶症 FDP正常 D D阳性 多数为FDP假阴性或继发性纤溶症 FDP阳性 D D阳性 多数为继发性纤溶症 常见于DIC 2 在诊断DIC中的应用见表5表5FDP和D D在诊断DIC中的应用 3 D D在排除静脉血栓 VTE 中的应用D D测定在排除VTE中有重要价值 表6 表6D D测定在排除VTE中的应用 方法学评价 1 对VTE的诊断 D D测定有高度敏感性和阴性预测值 但特异性较低 因此 D D测定阴性可排除VTE 阳性不一定是VTE 2 D D测定 WHO规定用ELISA法 临界值为500 g L 因此D D测定值 500 g L排除VTE 几乎为100 500 g L诊断VTE的可能性为40 必须结合其他影象检查 3 D D测定阴性时 结合临床低 中危险度 其排除价值更大 D D测定阳性时 结合临床高危险度和影象检查诊断价值更大 4 FDP和D D阳性可见于老年人 妊娠 癌肿 DIC 肝病 感染 炎症 创伤 手术 溶栓治疗 冠心病等 判断结果时要充分考虑 五 DIC筛选试验的应用 诊断DIC必须符合下列4项 1 引起DIC的基础疾病 病因诊断 2 有DIC的临床表现 临床诊断 3 DIC的实验室检查 实验诊断 4 对肝素治疗有效 治疗诊断 临床应用1 国外DIC的记分诊断标准 表9 2 国外DIC的记分诊断标准 表10 3 日本厚生省DIC诊断记分标准表11 注 计分 7分确诊DIC 计分6可疑DIC 5则可能性少 可疑时补做 Sfmc DD TAT PAP 动态plt 抗凝治疗有效 4 国内基层单位DIC诊断标准 1999 对临床怀疑 有下列7项中3项即可诊断DIC 1 PLT 50 109 L或进行性 2 Fg 1 5g L或 4 0g L 且呈进行性变化 3 3P试验 或FDP 20mg L 4 PT缩短 延长 3s 或呈动态变化 5 外周血涂片破碎红细胞 10 6 ESR 15mm h 7 血凝块在2h内出现溶解现象 方法学评价1 DIC常用实验指标的评价 表7 2 DIC联合实验指标分析 表8 方法学评价见表7 表8 我院对864例DIC患者进行统计 它们的敏感性 特异性和诊断准确率分别为60 66 和63 对DIC前期109例患者的敏感性 特异性和诊断准确率分别为80 68 和74 Wada等 2003 DIC的诊断标准作了前瞻性评价 结果显示 敏感性为91 特异性为97 由此可见 所用DIC实验诊断指标 基本上可以满足临床需求 六 自动化仪器在血栓与止血筛选试验中的应用 1 血栓弹力图 thrombelastograph TEG 承载全血标本的测试杯以4 45 左右摆动 当杯中凝血启动 置于杯中的金属针受到凝血块生成 溶解的切应力作用 随之一起摆动 金属针在摆动过程中所产生的电流 经电脑软件处理后 便形成曲线 这种仪器称血栓弹力仪 所形成的曲线称血栓弹力图 TEG 图6TEG各参数的形成 表12TEG主要参数及其含量 临床应用 1 判断凝血状态 低凝 高凝状态低凝状态 R K值都延长高凝状态 R K值都缩短指导血浆制品的选择 2 判断肝素 LMWH疗效 有效 过量 抵抗普通检测R K值 肝素R K值 示无肝素存在普通检测R K值 肝素R K值 示有肝素存在指导肝素 LMWH使用和鱼精蛋白中和 3 判断抗血小板治疗 有效 过量 抵抗用TEG的血小板定位图 plateletmapping 使用抗血小板药后血小板抑制率 20 为抵抗 使用抗血小板药后血小板抑制率50 75 为有效 4 评估非心脏手术后血栓事件的发生率应该维持MA值 67mm将大大降低血栓事件若MA值 67 72mm 血栓发生率为16 若MA值 72 95mm 血栓发生率为32 5 评估PCI后血栓事件的发生机率若PCI后 MA值 65 68mm 发生率为10 若PCI后 MA值 68 72mm 发生率为14 若PCI后 MA值 72mm 发生率为60 6 其他应用区别原发性纤溶和继发性纤溶 DIC 判断高凝状态原因 凝血亢进 血小板活性 鉴别手术出血 外科出血 内科出血 2 血小板功能分析仪 plateletfunctionanalyzer 100 PFA 100 体外筛选血小板黏附和聚集的仪器 以标有胶原 腺上腺素 CEPI 和胶原 ADP CADP 两种纤维膜为诱导剂 以观察膜孔闭合时间 closuretime CT 为结果 参考范围CEPI为61 203s CADP 48 187s InVivoHaemostasis PFA100 avi capillary200 m aperture150 m epinephrineorADP platelet vWF erythrocyte FLOW 40mbar collagen membrane PFA 100 TestPrinciple lumen fibrinogen platelet collagenfibrils erythrocyte endothelialcell vWF 临床应用一期止血缺陷的筛选试验 敏感性 CEPI CADP为82 5 66 9 特异性 CEPI CADP为88 7 85 5 阴性预测值 CEPI CADP为83 75 阳性预测值 CEPI CADP为88 79 vWD CEPI CADP的敏感性为88 87 特