蛋白质分离纯化幻灯片.ppt

蛋白质的分离纯化 产物大多处于细胞内 提取前需将细胞破碎 增加了很多困难 产物浓度较低 杂质多 而最后成品要求达到的纯度高 故提取较困难 且收率低 常需好几步操作并需采用高分辨力的精制方法 产物都是大分子蛋白质 通常不稳定 遇热 极端pH 有机溶剂和剪切力等易引起失活 重组蛋白的分离纯化过程特点 1蛋白质的分离方法 1 以大小或质量为依据 离心 300000g 凝胶过滤 Sephadex交联葡聚糖 Bio Gel交联聚丙烯酰胺 透析 超过滤 2 以电荷为依据 离子交换色谱 低离子强度 适当pH DEAE Sephadex CM Sephadex DEAE 纤维素 CM 纤维素 电泳 电荷 分子大小 分子形状 纤维素粉末 淀粉 聚丙烯酰胺 等电聚焦 pH梯度中的平衡位置 3 以溶解度变化为依据 改变pH 改变离子强度 降低介电常数 4 以特异性结合位置为依据 亲和色谱 亲和洗提 5 其它方法 热变性 在磷酸钙凝胶柱上分级吸附 羟基磷灰石色谱 疏水色谱 用水溶性的非离子聚合物 聚乙二醇 沉淀 冷冻干燥浓缩 1 以大小或质量为依据 1 1离心1 2凝胶过滤 1 1离心 原理 以质量不同为分离依据离心力 5000 50000g处理量可达几升分离对象 细胞碎片 沉淀下来的酶 高速离心速度一般在20 000g以下 超离心相对离心力场速度在75 000g以上 在80 000 250 000g之间 利用物质密度的不同 经超速离心后 分布于不同的液层而分离 1 主要分离小分子量酶 2 超速离心也可用来测定蛋白质的分子量 蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比 凝胶层析的基本原理 是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相 对混合物中各组份按分子大小进行分离的层析技术 又称为分子筛分子直径比凝胶最大孔隙直径大的 会被全部排阻在凝胶颗粒之外 即全排阻 两种全排阻的分子即使大小不同 也不能分开 它们下行速度快分子直径比凝胶最小孔隙直径小的 能进入凝胶颗粒的全部孔隙即使大小不同也不能分开 它们的下行速度慢鉴于上述原理 凝胶层析可用于重组蛋白溶液脱盐 分子量测定以及分离纯化 1 2凝胶过滤 A 原理 不同大小的分子进入颗粒状凝胶内微孔的能力不同 能进入微孔的小分子被阻滞 不能进入微孔的大分子未被阻滞 如图 B 换句话说 分离是因为不同分子在进入或不进入凝胶所经过的路程不同而达到分离的目的 C 其他名称 分子筛层析 凝胶渗透层析 排阻层析 Sephadex 交联葡聚糖 Bio Gel 交联聚丙烯酰胺 D 酶后期处理 小量试样 大分子 小分子 凝胶颗粒 凝胶排阻示意图解 大分子 小分子 凝胶颗粒 凝胶排阻示意图解 Vo Vt Vo Vi Vm Vt 凝胶柱床中Vt Vo等关系示意图 柱床体积 空隙体积 Vt 总体积Vo 外水体积Vi 内水体积Vm 凝胶基质体积 葡聚糖凝胶操作流程 1 选择根据分子量大小范围选择凝胶 凝胶如 G50排阻1 500 30 000 Sephadex 还有粗 中 细分 细的分辩率高 流速慢 粗的分辩率低 流速快 2 溶涨水浸或沸水煮 快而可以杀菌 防止微生物污染 3 装柱不能有气泡 用缓冲液平衡4 上样按柱床体积计算约1 40左右 然后用缓冲液洗脱 注意流速 5 再生稀盐和缓冲液洗涤 保存在液体中 为防止微生物生长 加0 02 NaN3或20 乙醇 使用时要注意可能抑制你要分离的酶 2 以电荷为依据 2 1离子交换色谱2 2电泳2 3等电聚焦 2 1离子交换色谱 取决于带相反电荷基团的静电吸引 离子交换层析基本原理 是以离子交换剂为固定相 以特定的含离子溶液为流动相 利用离子交换剂对分离的各种离子结合力的差异 而将混合物中不同离子进行分离的层析技术 1 离子交换剂亦称离子交换介质 通常是一种不溶性高分子化合物如树脂 纤维素 葡聚糖 琼脂糖等 2 离子交换剂中所含的可解离基团在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用 离子交换剂的基本性能 3 如果有两种以上的成分被吸附在离子交换剂上 则在用洗脱液洗脱时 各成分被洗脱的可能性取决于各自反应的平衡常数 4 吸附在离子交换剂上的蛋白质可通过改变pH使吸附的蛋白质失去电荷而解离下来 5 不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同 即亲和力大小有差异 因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐洗脱下来 达到分离纯化的目的 阴离子交换剂 强碱型和弱碱型 可电离的基团磺酸基 SO3H SP 离子交换剂的分类 磷酸基 PO3H2 羧酸基 COOH CM 酚羟基 OH 阳离子交换剂 强酸型和弱酸型 可电离的基团伯胺基 NH2 仲胺基 NHCH3 叔胺基 N CH3 2 DEAE 季胺基 N CH3 3 Q 离子交换介质的基本性质 离子交换剂的分类 强离子交换剂的电离率基本不受pH值影响 离子交换作用的pH范围宽 弱离子交换剂的电离率受pH影响很大 离子交换作用的pH范围小 弱酸性阳离子交换剂在pH值降低时 其电离率逐渐降低 离子交换能力逐渐减弱 弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时 其电离率逐渐降低 离子交换能力逐渐减弱 1 离子交换剂选择 考虑酶稳定性需要酶蛋白在 pI的pH条件下稳定用阳离子交换剂 酶蛋白在 pI的pH条件下稳定用阴离子交换剂在 pIpH pIpH条件下稳定二种交换剂都可用2 如何选择强型和弱型交换剂酶蛋白pI在9时考虑用强型离子交换剂酶蛋白是强型或弱型离子考虑到酶的不稳定性 交换剂通用 选弱型 离子交换介质的选择原则 1 2 3 4 6 7 8 9 10 5 等电点 吸附阴离子交换剂 吸附阳离子交换剂 蛋白质净电荷 pHpI 对pI 5的某酸性蛋白质当蛋白质为阴离子时 在pH5 5 9 0的范围内 应首选DEAE 当蛋白质为阳离子时 在pH3 5 4 5的范围内 应首选CM pH 样品进柱 为了达到满意的分离效果 进样量一般为小于介质交换容量的50 为了避免进样溶液中的离子强度过高 样品浓度不宜太高 交换容量 离子交换剂中全部可交换的离子或功能基团的总数 离子交换层析的基本操作 样品洗脱 10 20 30 40 50 60 70 80 90 离子交换层析的基本操作 pH值 分子浓度 离子强度 恒定洗脱 阶段洗脱 梯度洗脱 解吸方法 改变pH 改变结合基团的电荷 提高溶液的离子强度 与酶竞争结合位置 使用规模可大可小纯化倍数为10左右 控制好条件可以更高 2 2电泳 带电粒子在电场中移动的现象称为电泳 原理 在外加电场的影响下 带电分子具有不同的运动速度 不同的蛋白质分子所带电荷量不同 且分子大小也不同 故在电场中的移动速度也不同 据此可互相分离 蛋白质与多肽一样 能够发生两性离解 也有等电点 在等电点时 IsoelectricpointpI 蛋白质的溶解度最小 在电场中不移动 支持介质 纸 纤维素粉末 淀粉 聚丙烯酰胺 2 3等电聚焦 依据 在pH梯度中的平衡位置 用两性电解质 多乙烯多胺与丙烯酸的同系多异构体混合物 在电场作用下 形成连续平滑的pH梯度 而酶样品在其中也形成相同的等电点pH梯度 分辩率高 pI相差0 01pH的酶与蛋白质可分离 注意 在pI附近蛋白质容易沉淀 影响分离的数量和质量 3 以溶解度变化为依据 3 1盐析 改变pH 等电点沉淀法 3 2盐析 改变离子强度3 3PEG沉淀法 3 1改变pH 等电点沉淀法 调整pH至酶的等电点 原理 溶解度随分子引力加大而减小 其他条件相同 当pH在等电点附近时 分子引力最大 蛋白质就沉淀 一般不单独使用 配合其他方法使用 3 2改变离子强度 盐溶现象 加入离子有助于分散大分子上所带的电荷而使溶解度提高 盐析 离子强度提高到超过某一数值 带电分子将会沉淀下来 1 在蛋白质溶液中加入大量中性盐 以破坏蛋白质的胶体性质 使蛋白质从溶液中沉淀析出 称为盐析 2 常用的中性盐有 硫酸铵 氯化钠 硫酸钠等 3 盐析时 溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好 4 盐析沉淀蛋白质时 通常不会引起蛋白质的变性 特点 1 最古老 但应用广2 常用 NH4 2SO4 因为溶解度大0 时 NH4 2SO4溶解706g L 25 时 NH4 2SO4溶解767g L 在0 时也能把几乎所有的蛋白盐析出来 操作方式 常用加饱和 NH4 2SO4溶液或加固体 NH4 2SO4缺点 脱盐 对浓盐溶液透析 分辨率低 优点 简便 安全 重复性高 分段盐析半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白 而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白 4 1亲和色谱4 2亲和洗提 4 以特异性结合位置为依据 亲和层析 原理 酶的底物或竞争性抑制剂通过共价键与惰性载体 如琼脂糖 相连接 形成亲和载体 当混合物通过亲和载体时 酶由于与底物或竞争性抑制剂之间有非共价键特异性相互作用而保留在柱子上 其他酶和杂蛋白被洗出柱子 然后加入底物进行竞争 或改变pH或离子强度使结合的酶解吸 从而达到分离的目的 亲和层析的基本特点 亲和层析是利用待分离物质与其特异性配体之间特异性的亲和力进行分离的一类特殊的层析技术 它有如下特点 纯化过程简单 迅速 且分离效率高特别适用于分离纯化一些含量低 稳定性差的生物大分子纯化倍数大 产物纯度高必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件因此应用范围受到一定的限制 具有特异性亲和作用的生物分子 抗原与抗体DNA与互补DNA或RNA cDNA mRNA 酶与其底物 竞争性抑制剂 辅酶因子激素或药物与其受体维生素与其特异性结合蛋白糖蛋白与其相应的植物凝集素 亲和层析载体的选择 具有多孔的立体网状结构 能使被亲和吸附的大分子自由通过具有良好机械性能的均匀珠状颗粒 具有良好的流速具有惰性 尽量减少非专一性吸附具有相当量的易活化的基团 在温和的条件下能与配基共价合偶联在偶联 吸附和洗脱时 有较好的物理化学稳定性 常用的亲和层析载体 纤维素葡聚糖凝胶琼脂糖凝胶聚丙烯酰胺凝胶其它新型载体 亲和层析配基的选择 纯化对象和配基之间必须有较强的亲和力但亲和力太高也是有害的 因为在解离配基复合物时所需的条件就要强烈 这样可能使生物分子变性配基必须具有适当的化学基团 用于和载体相连 但这种基团不参与配基与生物分子之间特异结合 还不能影响配基与生物分子之间的亲和力 非专一性洗脱 通常采用改变pH 离子强度 离子种类或者温度等使固定配基与生物大分子结合的亲和力降低 但使用较广泛的是改变溶液的离子强度 非专一性洗脱剂的作用并不是使被吸附的生物大分子的构象发生变化 而是洗脱剂中的某一组分与固定配基形成复合物 使固定化的配基对相应的生物大分子的亲和力降低 专一性洗脱 使用特异的配基作为洗脱剂使用含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物溶液为洗脱剂 通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合来洗脱目标